Stroga kontrola rif1 od oct4 i smad3 presudna je za stabilnost matičnih ćelija embrionalnih matičnih stanica | stanična smrt i bolest

Stroga kontrola rif1 od oct4 i smad3 presudna je za stabilnost matičnih ćelija embrionalnih matičnih stanica | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Embrionalne matične stanice
  • Genska ekspresija
  • onkogcnczom

Sažetak

Produljena kultura matičnih stanica embriona (ESC) dovodi ih do usvajanja obilježja ćelija embrionalnog karcinoma, stvarajući ogromne opasnosti za njihovu daljnju primjenu. Mehanizam koji je uključen u stabilnost ESC-a nije, međutim, detaljno proučen. Ranije smo izvijestili da član obitelji SMAD 3 (Smad3) ima važnu ulogu u održavanju stabilnosti ESC miša, jer iscrpljivanje Smad3 rezultira svojstvima sličnim stanicama raka u ESC-ima, a Smad3 - / - ESC su skloni porastu velikih, zloćudnih teratoma. Da bismo razumjeli kako Smad3 doprinosi stabilnosti ESC-a, napravili smo analizu mikroračuna kako bismo usporedili transkript divljeg tipa i Smad3 - / - ESC-a. Otkrili smo da je Rif1 (protein R-1-povezan 1), faktor važan za stabilnost genoma, značajno reguliran u Smad3 - / - ESC-ima. Razina ekspresije Rif1 mora se strogo kontrolirati u ESC-ima, jer je niska razina Rif1 povezana s diferencijacijom ESC-a, ali visoka razina Rif1 povezana je s ESC transformacijom. U ESC-ima Oct4 aktivira Rif1 , dok Smad3 potiskuje njegov izraz. Oct4 regrutira Smad3 da se veže za Rif1 promotor, ali pridruživanje Smad3 olakšava učitavanje polkomb kompleksa koji generira represivnu epigenetsku modifikaciju na Rif1 promotoru i tako održava ekspresiju Rif1 na odgovarajućoj razini u ESC-ima. Zanimljivo je da su Smf3 - / - ESC-ovi koji prenose Rif1 kratku dlaku sa kratkim dlačicama pokazali manje zloćudna svojstva od kontrolnih ESC-a prenesenih shRNA Smad3 - / - , što sugerira kritičnu ulogu Rif1 u održavanju stabilnosti ESC-a tijekom proliferacije.

Glavni

Embrionalne matične stanice (ESC) mogu služiti kao bogat izvor diferenciranih stanica za staničnu terapiju zbog pluripotencije i neograničenih kapaciteta samoobnove. Međutim, produljena kultura ESC-a dovodi do toga da ESC-i akumuliraju brojne mutacije, te postupno usvajaju značajke ćelija embrionalnog karcinoma. 1, 2, 3 To izaziva ozbiljne sigurnosne probleme u vezi s ESC aplikacijama i također postavlja važna pitanja u vezi s načinom na koji ESC održavaju svoju genomsku stabilnost.

Pretvaranje beta (TGF- β ) signalizacije faktora rasta ima važnu ulogu u razvoju i homeostazi. Djeluje i kod više bolesti poput raka, fibroze tkiva i dijabetesa. 4, 5 TGF- P / Activin / Nodal aktivira članove porodice SMAD (Smad) 2 / Smad3 putem svojih ligandskih receptora. Aktivirani Smads se vežu na Smad4 i prenose se iz citoplazme u jezgru radi regulacije gena nizvodno. 6, 7 TGF- p / Activin / Nodalna signalizacija presudna je za održavanje samoobnove i pluripotencije u ljudskim ESC-ima, ali čini se da nije neophodna za pluripotenciju mišjih ESC-a. 8, 9 Umjesto toga, za širenje ESC-ova miša potrebno je aktiviranje Activin / Nodal signalizacije. 10, 11 Smad3 je silazni faktor TGF- p / Activin / Nodal signalizacije. Iako iscrpljivanje Smad3 dovodi do prolaznog izobličenja izobličenja markera mezoderme tijekom stvaranja embrioidnog tijela (EB), konačna tvorba roda nije pogođena, 12 jer su Smad3 izbijeni miševi održivi i plodni. 13 To je možda zato što Smad2, još jedan nizvodni faktor TGF- p / Activin / Nodal signalizacije, ima suvišnu ulogu Smad3. Zabilježeno je da Smad2 i Smad3 zajedno reguliraju stvaranje mezoderme tijekom razvoja embrija. 12, 14 Prije toga, otkrili smo da je aktiviranje Smad3 od vitalnog značaja za ESC-e za održavanje svog genetskog integriteta tijekom razmnožavanja, jer iscrpljivanje Smad3 dovodi mišje ESC-e da usvoje svojstva stanica raka. 12 Kako bismo dodatno ilustrirali kako Smad3 doprinosi stabilnosti ESC-a, napravili smo mikroarray test kako bismo identificirali gene koji pokazuju očitu promjenu nakon Smad3 iscrpljivanja. Među genima pogođenima Smad3-om , Rf1 (RAP1-povezani protein 1), faktor usko povezan s kromatinskom stabilnošću, pokazuje najveću regulaciju.

Rif1 je najprije identificiran u kvascu koji pupa, kao faktor koji djeluje Rap1. Regrutuje se u telomere pomoću Rap1 i sudjeluje u održavanju strukture telomera i homeostazi. 15, 16 U stanicama sisavaca, osim regulacije homemeze telomera, 17, 18 Rif1 posreduje ATM (mutirana ataksija telangiektazija) / 53BP1 (protein supresor p53 koji veže protein 1) signalizirajući nakon oštećenja DNA kako bi potisnuo prekid resekcije i promicao ne- mehanizam homolognog završnog spajanja (NHEJ) u fazi G1. 19, 20, 21, 22, 23 Osim toga, Rif1 na globalnoj razini regulira program-vremena umnožavanja i u fisiji kvasca i u stanicama sisavaca. 24, 25, 26, 27 Rif1 locira zaustavljene vilice za replikaciju kao odgovor na ATR aktivaciju i služi kao sastavni dio kontrolne točke replikacije DNK. 28, 29, 30, 31 Rif1 je također jako eksprimiran u pluripotentnim matičnim stanicama. 32, 33, 34 Srušenje Rif1 interferencijom RNA u mišjim ESC-ima dovodi do diferencijacije ESC-a. 35

U ovom istraživanju utvrđujemo da je Rif1 važan doprinos stabilnosti ESC-a tijekom širenja. Razina ekspresije Rif1 strogo je kontrolirana od strane Smad3 i Oct4. Smanjenje Rif1 interferencijom RNA dovodi do toga da Smad3 - / - ESC pokazuju manje maligna svojstva od kontrolnog SmR3 srušena shRNA , / što upućuje na zaključak da je regulacija Rif1 ključni faktor u transformaciji Smad3 - / - ESC.

Rezultati

Rif1 je izravna meta Smada3 nizvodno

Ranije smo izvijestili da iscrpljivanje Smad3 u mišjim ESC-ima stvara karakteristike slične stanicama raka. 12 Da bi se razumio temeljni mehanizam, provedena je analiza cDNA mikrorasta kako bi se usporedio transkript između divljeg tipa (WT) i Smad3 - / - ESC. Geni s više od 1, 5 puta razlike između WT i Smad3 - / - ESC odabrani su od strane Partek softvera za generiranje toplinske karte. Na temelju podataka o mikroračunu , ekspresija Smad3 i Lefty1 je značajno smanjena u Smad3 - / - ESC. Osim toga, validacija osam nasumično odabranih gena pomoću PCR-a u stvarnom vremenu nadalje sugerira da je rezultat mikroračuna pouzdan. Među genima koji pokazuju različitu ekspresiju nakon Smad3 iscrpljivanja, Rif1 je rangiran kao najregulisaniji gen u Smad3 - / - ESC-ima (slika 1a i dopunska slika S1A). Analiza PCR-a i Western blot-a u stvarnom vremenu potvrdila je povećanje regulacije Rif1 i na razini mRNA i proteina u Smad3 - / - ESC-ima (slike 1b i c). Nadalje, prekomjerna ekspresija Smad3 u Smad3 - / - ESC može značajno smanjiti Rif1 ekspresiju, ali povećati Lefty1 izraz (Slika 1d). Kako je Smad3 silazni faktor puta Activin u mišjim ESC-ima, 10 smo tretirali ESC s Activin A (25 ng / ml) i inhibitor Activin A SB431542 (10 μM), kako bismo ispitali ekspresiju Rif 1. Kao što se očekivalo, ekspresija Rif1 smanjena je liječenjem Activin A, ali povećana liječenje SB431542. Izraz Lefty1 i Lefty2 reguliran je obrnuto, potvrđujući da Lefty1 i Lefty2 pozitivno reguliraju put Activin / Smad3, dok je Rif1 ovim putem negativno reguliran (slike 1e i f). Na osnovu podataka o imunoprecipitaciji od Chullen-ove kromatinske tvari (ChIP), postoje dva mjesta za vezanje Smad3 (SBS1 i SBS2) na promotorskom području Rif1. 4 Stoga smo dizajnirali primere za kvantitativnost Rif1-1 i Rif1-2 područja koja pokrivaju SBS1 i SBS2. Ispitujući DNK obogaćenu ChIP-om pomoću PCR-a u stvarnom vremenu, otkrili smo da se Smad3 specifično veže za regije Rif1-1 i Rif1-2 (slika 1 g). Da bi se dalje ispitalo je li na aktivnost promotora Rif1 utjecala iscrpljenost Smad3 , provedeno je ispitivanje luciferaze s promotorom Rifl koji sadrži mjesta koja vežu Smad3. Rezultat je pokazao da je aktivnost promotora Rif1 pojačana u Smad3 - / - ESC-ima u usporedbi sa WT ESCs (slika 1h). Uzeto zajedno, svi ovi podaci pokazali su da je Rif1 meta puta Activin / Smad3, te da Smad3 potiskuje Rif1 izraz u mišjim ESC-ima.

Image

Smad3 potiskuje Rif1 izraz u ESC- ovima . ( a ) Toplinska karta prikazuje profil ekspresije gena s razinom mRNA povećanom ili smanjenom za više od 1, 5 puta u Smad3 - / - ESC-ima u usporedbi s WT ESCs. Lefty1 i Smad3 su smanjeni, dok se Rif1 povećava u Smad3 - / - ESC-ima u usporedbi s WT ESCs. ( b ) Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu za ispitivanje mRNA razine Rif1 u WT i Smad3 - / - ESC-ima. Actin je analiziran kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( c ) Western blot i denzitometrijske analize ekspresije Rif1 u WT i Smad3 - / - ESC. Gapdh nivo ekspresije korišten je kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 2). ( d ) Western blot analiza Smad3 (gornji sloj) i PCR analiza u stvarnom vremenu Lefty1 i Rif1 (donji sloj) u pCAG- GFP- i pCAG- Smad3 -transficirani Smad3 - / - ESC. Razina proteina Gapdh i ekspresija Actina korišteni su kao interne kontrole za Western blot i PCR analizu u realnom vremenu. Strelica označava pojas prekomjerne ekspresije zastave-Smad3. PCR podaci u stvarnom vremenu prikazani su kao prosjek ± SD ( n = 3). ( e ) Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu za ispitivanje nivoa ekspresije mRNA Lefty1, Lefty2 i Rif1 u mišjim ESC- ovima sa postupkom Activin A (25 ng / ml) tijekom 0 i 24 h. Actin je analiziran kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( f ) Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu za ispitivanje nivoa ekspresije mRNA Lefty1, Lefty2 i Rif1 u mišjim ESC-ima sa SB431542 (10 µM) tretmanom 0 i 24 h. Actin je analiziran kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( g ) ChIP-qPCR za ispitivanje obogaćivanja Smad3 i IgG na promotoru Rif1 . Skica mjesta za vezanje Smad3 na promotoru Rif1 naznačena je (SBS1 i SBS2), regije Rifl -1 i Rif1 -2 pokrivaju SBS1, odnosno SBS2. Obogaćivanje proteina na Actinu analizirano je kao kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( h ) Analiza luciferaze za ispitivanje Rif1 promotorske aktivnosti u WT i Smad3 - / - ESCs 48 h nakon transfekcije. Kub promotora Rib1 od dvije kb kloniran je pred izvještačem luciferaze krijesnica. Renilla je analizirana kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). Navedene su statistički značajne razlike, izračunate pomoću t- testova učenika (* P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001)

Slika pune veličine

Profili obrnutog izraza između Smad3 i Rif1

Da bismo dalje ispitali povezanost između Smad3 i Rif1 , ispitali smo profile ekspresije ova dva gena u mišjim ESCs, mišjim embrionalnim fibroblastima (MEF), teratomskim stanicama i mišjim diferenciranim ESC stanicama. Smad3 pokazao je veću ekspresiju u MEF-u i stanicama teratoma nego u ESC-ima. Suprotno tome, Rif1 je eksprimiran na nižoj razini u stanicama MEF i teratoma nego u ESC (dopunske slike S1B, S1C i S2A). Pored toga, pratili smo i ekspresijske promjene Smad3 i Rif1 tijekom ESC diferencijacije koristeći monoplast kulturu i stvaranje EB (dopunske slike S1D i S2B). Diferencijaciju ESC-a pratila je postupna redukcija pluripotentnih markera i izražavanje biljega roda (dopunske slike S1E i S2C). Tijekom ESC diferencijacije, ekspresija Smad3 mRNA je postupno povećana, dok je ekspresija Rif1 mRNA smanjena (dopunske slike S1F i S2D). Zanimljivo je da je, premda je izraz Rif1 smanjen u EB-ima formiranim u ESC-u, razina Rif1 uvijek bila veća u Smad3 - / - EB-ima u obliku ESC-a nego u EB-u u obliku WT ESC-a u istoj fazi, što sugerira da Smad3 je jedna od ključnih komponenti koja regulira Rif1 ekspresiju tijekom ESC diferencijacije (dopunska slika S2E). Ovi profili izraza također potvrđuju prijašnja izvješća da je Rif1 faktor povezan s pluripotencijom. 32, 35

Za Smad3 je potreban Oct4 da se veže za Rif1 promotora

Otkriveno je da više Sm43 zajedno zauzima više gena vezanih za Oct4 i reagiraju na TGF- β signalizaciju. 4 Da bismo otkrili da li je Rif1 među tim genima, prvo smo srušili izraz Pou5f1 interferencijom RNA. Razina ekspresije Rif1 značajno je smanjena nakon propadanja Pou5f1 (Slika 2a). To je u skladu s aktivnostima luciferaze Rif1 promotora smanjenim na 20% nakon propadanja Pou5f1 , sugerirajući da je Rif1 reguliran listopadom 4 (slika 2b). Nadalje, prekomjerna ekspresija Pou5f1 u mišjim ESC-ima može poboljšati ekspresiju Rif1 i na razini mRNA i proteina (Slike 2c i d). Da bismo utvrdili da li se Oct4 veže sa Smad3 na Rif1 promotorskoj regiji, izveli smo ChIP test s Oct4 antitijelom. Kao što se i očekivalo, Oct4 je bio visoko obogaćen na promocijskim područjima Rif1 gdje se Smad3 veže (Slika 2e). Ovi podaci podržavaju prethodna izvješća da Oct4 pozitivno regulira Rif1 ekspresiju u mišim ESC-ima. 33, 35

Image

Oct4 pozitivno regulira Rif1 i neophodno je da se Smad3 veže na Rif1 promotorske regije. ( a ) Kvantitativni PCR u realnom vremenu za ispitivanje mRNA razine Pou5f1 i Rif1 nakon transfekcije pSuper kontrolom i pSuper- Pou5f1- shRNA plazmidima. Aktin je analiziran kao kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( b ) Analiza luciferaze radi ispitivanja aktivnosti Rifl promotora u mišjim ESC-ima transfektiranim pSuper kontrolom i pSuper- Pou5f1- shRNA plazmidima. Renilla je analizirana kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( c ) Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu za ispitivanje mRNA razine Pou5f1 , Lefty1 i Rif1 nakon transfekcije pCAG- GFP i pCAG- Pou5f1 plazmidima. Aktin je analiziran kao kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( d ) Analiza Western blot nivoa proteina Oct4 i Rif1 u mišjim ESC-ima transfektiranim pCAG- GFP i pCAG- Pou5f1 plazmidima. Gapdh je analiziran kao kontrola. Strelica označava pojavu prekomjerne ekspresije zastave-listopad4. ( e ) ChIP-qPCR za ispitivanje obogaćivanja DNK Oct4 i kontrolu IgG na mjestima koja vežu Smad3 na promotoru Rif 1 u mišjim ESC-ima. Obogaćivanje proučenih proteina na Actinu analizirano je kao kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( f ) ChIP-qPCR radi ispitivanja obogaćivanja Oct4 na Lefty1 , Lefty2 i Rif1 u WT i Smad3 - / - ESC - ovima. Aktin je analiziran kao kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( g ) ChIP-qPCR za ispitivanje obogaćivanja Smad3 na Lefty1 , Lefty2 i Rif1 pri jednodnevnom odabiru puromicina nakon što su mišji ESC transfektirani pSuper kontrolom i pSuper- Pou5f1 -shRNA plazmidi. Smanjenje Smad3 na Actinu analizirano je kao kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( h ) Izvršeno je sekvencijalno ispitivanje ChIP-a za ispitivanje obogaćivanja Smad3 i IgG na DNA obogaćenim oktobrom. Količina obogaćenih fragmenata Lefty1 , Lefty2 i Rif1 ( Rifl -1 i Rif1 -2) provjerena je PCR-om u stvarnom vremenu. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). Navedene su statistički značajne razlike, izračunate pomoću t- testova učenika (* P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001)

Slika pune veličine

Kroz ko-imunoprecipitaciju i uzastopne eksperimente sa ChIP-om, Mullen i sur. 4 su otkrili da Oct4 može formirati kompleks sa Smad3 i regrutovati Smad3 u Lefty1 pojačivač za regulaciju Lefty1 ekspresije u mišjim ESC-ima. Potaknuti suprotnim regulatornim ulogama Smad3 i Oct4 na Rif1 , prvo smo ispitali je li Smad3 potreban da se Oct4 veže za Rif1 promotora. Kako je razina proteina Oct4 slična u WT i Smad3 - / - ESC, 12 izravno smo izvršili ChIP test s Oct4 antitijelima. Otkrili smo da na obogaćivanje listova Oct4 na Lefty1 , Lefty2 i Rif1 u WT i Smad3 - / - ESC nije očigledno utjecalo iscrpljivanje Smad3 (slika 2f). Zatim smo istražili je li Oct4 potreban da bi se Smad3 regrutovao za vezanje za Rif1 . ShRNA smo srušili Pou5f1. Nakon jednodnevne selekcije puromicinom, razina mRNA Pou5f1 značajno je smanjena, ali ekspresija Smad3 , pluripotentnog markera Nanog , linijskih markera Cdx2 , Cxcr4 i T nisu se značajno promijenili i ESC-i su i dalje održavali morfologiju kolonije (dopunska slika S3A), U međuvremenu, razina proteina Oct4 očito je smanjena, dok Smad3 nije utjecao (dopunska slika S3B). Proveli smo ChIP test sa Smad3 antitijelom koristeći stanice u ovoj fazi i utvrdili da je učinkovitost vezanja Smad3 na Lefty1 , Lefty2 i Rif1 značajno smanjena nakon knockdown-a Pou5f1 (Slika 2g). Da bismo dodatno potvrdili da se Oct4 i Smad3 vežu za promotor Rif1 , nakon listopada ChIP4 proveli smo ponovni ChIP test sa Smad3 antitijelom i otkrili da se Smad3 i Oct4 vežu istovremeno za Rif1 promotor (Slika 2h). Ovi podaci sugeriraju da je Oct4 potreban da bi se Smad3 mogao vezati na Rif1 promotor, ali Smad3 nije potreban za vezanje Oct4.

Rif1 promotor pokazuje metilaciju H3K27 ovisnu o Smad3

Mullen i sur. 4 su izvijestili da Activin može potaknuti i regulaciju i smanjivanje ekspresije gena okupiranih Oct4 i Smad3, što pokazuje da Oct4 i Smad3 reguliraju svoje ciljeve sofisticiranim regulatornim mehanizmima. Da bismo otkrili kako Oct4 i Smad3 reguliraju Rif1 , izveli smo test ChIP-a s markerima modifikacije histona, H3K9me2, H3K9me3, H3K4Me3 i H3K27Me3. H3K9me2 i H3K9me3 označavaju heterokromatin, a H3K4me3 i H3K27me3 bivalentni su markeri koji označavaju gene koji se odnose na pluripotenciju i diferencijaciju. 36, 37, 38 Rif1 promotor je obogaćen H3K4me3 i H3K27me3, ali ne i H3K9me2 i H3K9me3 (Slike 3a i d). Iscrpljivanje Smad3 nije utjecalo na obogaćivanje H3K4me3 (Slika 3c), ali ozbiljno je utjecalo na obogaćivanje H3K27me3. Međutim, razina H3K27me3 na Lefty1 i Lefty2 očito nije utjecala nakon Smad3 iscrpljivanja (Slika 3d). Ovaj rezultat podrazumijeva da Rif1 ekspresiju kontrolira specifična epigenetska modifikacija koja uključuje Smad3. Kako je Suz12 ključna komponenta represivnog kompleksa polikkombe (PRC2) i doprinosi H3K27me3, proučili smo ChIP test sa Suz12 antitijelom. Otkrili smo da je obogaćivanje Suz12 na Rif1 značajno smanjeno nakon iscrpljivanja Smad3 , ali je njegovo obogaćivanje na Lefty1 i Lefty2 bilo stabilno (slika 3e). Uzeto zajedno, ovi podaci sugeriraju da se, iako se Oct4 i Smad3 vežu za Lefty1 , Lefty2 i Rif1 , mehanizam koji se koristi za regulaciju Rif1 razlikuje od mehanizma koji se koristi za regulaciju Lefty1 i Lefty2 . U regulatornom kompleksu Rif1 , Smad3 ima kritičnu ulogu pri učitavanju PRC2 da regulira ekspresiju Rifl kroz metilaciju H3K27.

Image

Rif1 promotor pokazuje o metiliranju HIP-qPCR-a o H3K27 o Smad3 radi ispitivanja ( a ) H3K9me2, ( b ) H3K9me3, ( c ) H3K4Me3, ( d ) H3K27Me3 i ( e ) obogaćivanja Suz12 na Lefty1 i Lefty2 pojačivaču i Rif1 promotora i WT promotora u WT-u. - / - ESC - ovi. Obogaćeni Actin analiziran je kao negativna kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). Navedene su statistički značajne razlike, izračunate pomoću t- testova učenika (* P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001)

Slika pune veličine

Smad3 - / - ESC pokazuju veću proliferaciju stanica i sposobnost popravljanja DNK od WT ESC nakon ultraljubičastog zračenja

Naše prethodne studije pokazale su da iscrpljivanje Smad3 povećava sposobnost anti-apoptoze ESC-a. Kako bismo dodatno potvrdili ovo zapažanje, odlučili smo detaljno ispitati reakciju WT i Smad3 - / - ESC na oštećenje DNA. Prije ultraljubičastog (UV) zračenja, WT i Smad3 - / - ESC nisu pokazali očitu razliku nakon bojenja propidium jodidom (PI). Nadalje, obilježavanje stanica bromodeoksiuridinom (BrdU) otkrilo je da više Smad3 - / - ESC-ova pokazuje aktivnu replikaciju DNK nego WT ESC. WT i Smad3 - / - ESC su tada bili izloženi UV zračenju (40 mJ / cm 2 ) kako bi izazvali oštećenja DNA. Pet sati kasnije, stanice su označene pulsom BrdU i kultivirane još 30 minuta. Nakon toga, stanice su sakupljene i obojene sa PI i FITC-konjugiranim BrdU antitijelom za analizu protočne citometrije. Oko 7% Smad3 - / - ESC-a pokazalo je aktivnu replikaciju DNK u usporedbi sa samo oko 3% za WT stanice (Slike 4a i b). Ovaj rezultat pokazao je da Smad3 - / - ESC-i imaju veću sposobnost proliferacije stanica nego WT ESC-ovi nakon oštećenja DNA.

Image

Smad3 - / - ESC pokazuju pojačanu proliferaciju stanica i sposobnost popravljanja DNA nakon UV zračenja. ( a ) Reprezentativni protočni citometrijski točki BrtU integrirani WT (WT1 i WT2) i Smad3 - / - ( Smad3 - / - 1 i Smad3 - / - 2 ) ESC na 0 i 6 h nakon UV zračenja. x os predstavlja sadržaj DNK kroz PI mrlju, a osi y predstavlja stanice označene sa BrdU-FITC. ( b ) Statistička analiza postotka brdU-pozitivnih stanica iz dva neovisna pokusa. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 2). ( c ) Western blot i denzitometrijske analize ekspresije RPA2 u WT (WT1 i WT2) i Smad3 - / - ( Smad3 - / - 1 i Smad3 - / - 2 ) ESC prije, a 1 i 3 sata nakon, UV (40 mJ / cm 2 ) zračenja. Gapdh nivo ekspresije korišten je kao unutarnja kontrola. Podaci denzitometrija prikazani su kao prosjek ± SD ( n = 2). ( d ) Western blot i denzitometrijske analize izraza pChk1 (Ser345) i pChk2 (Thr68) u WT (WT1 i WT2) i Smad3 - / - ( Smad3 - / - 1 i Smad3 - / - 2 ) ESC-ovi prije, i 1 i 3 sata nakon, UV (40 mJ / cm2) zračenja. Gapdh nivo ekspresije korišten je kao unutarnja kontrola. Podaci denzitometrija prikazani su kao prosjek ± SD ( n = 2). ( e ) Western blot i denzitometrijske analize ekspresije pH2AX (Ser139) u WT (WT1 i WT2) i Smad3 - / - ( Smad3 - / - 1 i Smad3 - / - 2 ) ESC prije i 6 sati nakon, UV (40 mJ / cm 2 ) zračenje. Gapdh nivo ekspresije korišten je kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 2). Navedene su statistički značajne razlike, izračunate pomoću t- testova učenika (* P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001)

Slika pune veličine

Kao odgovor na oštećenje DNA nakon UV zračenja, ATR-Chk1 i ATM-Chk2 aktiviraju se za moduliranje kontrolne točke, popravka DNK, apoptoze i starenja stanica. Replikacijski protein A (RPA) je protein koji veže ssDNA u eukariotama i sprječava da ssDNA formira strukture dlačica ili ponovno žarenje kada se DNA popravlja, replikacija ili rekombinacija. 39, 40, 41, 42 RPA se regulira nakon oštećenja DNK i bitno je za kontrolnu točku oštećenja DNA posredovanu ATR-om. 43, 44 Smad3 - / - ESC-i izrazili su značajno višu razinu RPA od WT ESC-a 1 sat i 3 sata nakon UV zračenja (Slika 4c). U skladu s tim, fosforilirani Chk1 bio je značajno veći u Smad3 - / - ESC nego WT ESCs, dok je fosforilirani Chk2 samo neznatno porastao u Smad3 - / - ESC (Slika 4d). Ovi podaci podrazumijevaju povišeni odgovor oštećenja DNA u Smad3 - / - ESC-ima.

H2AX, varijanta histona H2A, fosforiliran je ATM-om nakon oštećenja DNA. Veže se za oštećenu DNK i privlači više proteina koji će se pridružiti popravljanju DNK, pa je to dobar pokazatelj oštećenja DNK. 45, 46, 47, 48 Značajne količine H2AX otkrivene su u WT i Smad3 - / - ESC 1 sat nakon UV zračenja, što ukazuje na znatna oštećenja DNK u ovim stanicama (dopunska slika S5A). Međutim, 6 sati nakon UV zračenja, fosforilirani H2AX bio je značajno manji u Smad3 - / - ESC nego WT ESCs (slika 4e), što ukazuje da je u ovom trenutku manje oštećena DNA ostala u smad3 - / - ESC. Sva ova zapažanja potvrđuju da Smad3 - / - ESC-i imaju poboljšanu sposobnost popravljanja DNA nakon UV zračenja. Pokazalo se da je Rif1 vrlo povezan s reakcijom oštećenja DNK i aktiviranjem kontrolne točke. 30, 48 Analizirali smo razinu fosforilacije Chk1 u Smad3 - / - ESC-ima nakon transfekcije s Rifl shRNA i tretirani s UV zračenjem. Fosforilirani Chk1 značajno je smanjen u Smad3 - / - ESC-u srušavanja Rif1 u usporedbi s kontrolnim padom Smad3 - / - ESC (dopunska slika S5B), što sugerira da uregulacija Rif1 u Smad3 - / - ESC-ima posreduje pojačanom oštećenju DNA nakon UV zračenja.,

Smanjena stanična proliferacija padom Rif1 u Smad3 - / - ESC-ima

Kako bi se provjerilo je li regulacija Rif1 glavni faktor za Smad3 - / - ESC-proliferaciju, izgrađene su dvije shRNA koje ciljaju na dvije različite regije gena Rif1 . Oboje su mogli učinkovito smanjiti Rif1 i na razini mRNA i proteina. Srušenje Rif1 uzrokovalo je diferencijaciju ESC-a snižavanjem regulacije pluripotentnih markera alkalnom fosfatazom (AP) i Oct4 te povećanjem diferencijacijskih markera Cdx2 , Gata6 , T i Fgf5 (dopunske slike S4A-S4D). Zatim smo transficirali Rif1 shRNA u Smad3 - / - ESC. Otkrili smo da se razina ekspresije Rif1 u Smad3 - / - ESC-ima može smanjiti na približno razinu Rif1 u WT ESC-ima pomoću RiR1 shRNA nakon odabira s puromicinom tijekom 3 dana (slike 5a i b). Da bismo stalno smanjivali ekspresiju Rif1 u Smad3 - / - ESC-ima, pretvorili smo Smad3 - / - ESC s lentivirusom u stabilnu ekspresiju Rif1 shRNA. Odabirom većeg broja jednoćelijskih kolonija uspjeli smo odabrati Smad3 - / - ESC sa stabilno smanjenim Rif1 . Smad3 - / - ESF-transducirani shRNA-om izraženi su značajno nižim Rif1 od Smad3 - / - ESC-ova i kontroliraju shRNA-transducirani Smad3 - / - ESC-i, ali sličnu razinu Rif1 do WT ESC-a (Slika 5c). Ti Smf3 - / - ESC-ovi transducirani shRNA-om mogu se još širiti. Ekspresija Ccnd2 (ciklin-D2), koja je povećana u Smad3 - / - ESC, 12 značajno je smanjena redukcijom Rif1 (Slika 5d). Osim toga, analiza integracije BrdU otkrila je da je broj razmnožavajućih stanica u Rif1 pad Smad3 - / - ESC-a znatno smanjen na približno WT ESC razinu (slike 5e i f), sugerirajući da je regulacija Rif1 u Smad3 - / - ESC-ima jedna od glavnih čimbenici koji povećavaju širenje ESC-a.

Image

Srušenje Rif1 u Smad3 - / - ESC-ima može smanjiti proliferaciju stanica. ( a ) Morfološke pojave WT ESC-a, Smad3 - / - ESC-i i kontrolni shRNA- i Rif1 shRNA-pretvoreni Smad3 - / - ESC-i. Linija mjerila = 200 µm. ( b ) Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu za ispitivanje mRNA razine Rif1 u WT ESC i Smad3 - / - ESC nakon transfekcije s kontrolnim plazmidima shRNA i Rif1 shRNA. Actin je analiziran kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( c ) Western blot i denzitometrijske analize ekspresije Rif1 u WT, Smad3 - / - ESC-ima i kontrolnim shRNA- i Rif1 shRNA-transduciranim Smad3 - / - ESC-ima. Gapdh nivo ekspresije korišten je kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 2). ( d ) Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu za ispitivanje razine mRNA Ccnd2 u WT ESC-ima i kontrolu šRNA- i Rif1 shRNA-prevedenih Smad3 - / - ESC-a. Actin je analiziran kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). Navedene su statistički značajne razlike, izračunate na studentskim t- testovima (* P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001). ( e ) Bojenje imunofluorescencije BrdU antitijelom za ispitivanje BrdU integracije u WT ESC i kontrolu ŠDNA-i Rifl shRNA-transduciranih Smad3 - / - ESC-a. Stanice su pulsno obilježene BrdU 30 minuta, a zatim fiksirane za BrdU bojenje. Jezgra su obojena DAPI. Linija mjerila = 200 µm. ( f ) Analiza protočne citometrije procenta integracije BrdU (puls označen sa 30 min) u WT, kontrolni ESR-ovi koji prelaze shRNA- i Rif1 shRNA. x osa predstavlja postotak BrdU-FITC ćelija i y os predstavlja broj stanica

Slika pune veličine

Kapacitet stanične migracije Smad3 - / - ESC diferenciranih stanica smanjuje se padom Rif1

Smad3 - / - ESC-diferencirane stanice pokazuju pojačanu staničnu migraciju. 12 Da bismo ispitali doprinosi li regulacija Rif1 staničnoj migraciji (dopunska slika S6A), izvršili smo testove zacjeljivanja rana i transwella. Nakon induciranja ESC diferencijacije povlačenjem 2i i inhibicijskog faktora leukemije (LIF), nastala je ogrebotina od rane. Tri sata nakon ogrebotine, nije bilo očigledne razlike u ranu između razdvajanja kontrolnih i ShfNA-transduciranih Smad3 - / - ESC-diferenciranih stanica. No, u 12 sati nakon ogrebotine, jaz rana u kontrolnom uzorku bio je uži od Rif1 uzorka, što sugerira smanjeni kapacitet migracije stanica uzrokovan padom Rif1 . Ta je razlika bila očiglednija nakon 24 sata (slika 6a). Pored toga, probni test je također otkrio da Rif1 propadne Smad3 - / - ESC-diferencirane stanice imaju niži kapacitet migracije u odnosu na kontrolnu (Dodatna slika S6B). To je u skladu s markerima migracije ćelije Mmp2 i Mmp9 koji su značajno smanjeni u Rif1 pad- Smad3 - / - ESC diferenciranim ćelijama u usporedbi s kontrolnim knockdown uzorcima (dopunska slika S6C).

Image

Srušenje Rif1 u Smad3 - / - ESC-i mogu smanjiti migraciju stanica. ( a ) Slika (gornja) i histogram (donja) zacjeljivanje rana ogrebotina ogrebotinama WT ESC-a i kontrola ShRNA- i Rif1 shRNA-transformiranih Smad3 - / - ESC-diferenciranih stanica u 3, 12 i 24 sata nakon ogrebotine. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 2). ( b ) Slika SCID miševa s tumorima 4 tjedna nakon WT ESC-a, Smad3 - / - ESC i Smad3 - / - ESR-a transduciranih ShRNA subkutano su inkutirani u SCID miševe. ( c ) Genotipizacijom tumora formiranih ES stanicama kako bi se potvrdila integracija Rif1 shRNA u Rif1 shRNA transducirane stanice Smad3 - / - ES. ( d ) Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu za ispitivanje nivoa mRNA Smad3 , Rif1 , Ccnd2 , Mmp2 i Mmp9 u tumorima uzgojenim iz WT ESC, Smad3 - / - ESC i Smad3 - / - ESC-transduciranih ShRNA. Actin je analiziran kao unutarnja kontrola. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD ( n = 3). ( e ) Bojenje imunofluorescencije anti-PCNA antitijelom za ispitivanje PCNA ekspresije u WT ESC, kontroliranje Smad3 - / - ESC i Rif1 shRNA-transduiranih Smad3 - / - ESC-formiranih teratoma. Jezgra su obojena DAPI. Linija mjerila = 200 μ m. ( f ) Kvantifikacija postotka ćelija pozitivnih na PCNA u usporedbi s DAPI u WT ESC, kontrolni Smad3 - / - ESC i Rif1 shRNA prenose Smad3 - / - ESC-formirane teratome. Navedene su statistički značajne razlike, izračunate pomoću t- testova učenika (* P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001)

Slika pune veličine

Smf3 prevođen Rif1 shRNA-om - ESC-i čine manje-zloćudne teratome

Da bismo istražili da li je regulacija Rif1 odgovorna za Smad3 - / - ESC-ove koji formiraju maligni teratom, supkutano smo ubrizgali WT, Smad3 - / - ESC i Rif1 shRNA-transduciranu Smad3 - / - ESC u SCID miševe. Četiri tjedna kasnije, svi ubrizgani ESC stvorili su tumore. Smad3 - / - ESC-i su tvorili najveće tumore, a Smad3 - / - prenose Rif1 shRNA-om najmanji tumori (Slika 6b). Isti rezultat je dobiven testom ponovljenog ubrizgavanja. Bojenje hematoksilinom i eozinom otkrilo je da su svi ti tumori bili teratomi s tkivima tri klice sloja (dopunska slika S6D). Genotipizacija tumorskih uzoraka potvrdila je integraciju Rif1 shRNA u stanice teratoma proizvedene od Rifl shRNA-transduciranih Smad3 - / - ESC-a (Slika 6c). Nadalje, gen za proliferaciju stanica Ccnd2 i geni za staničnu migraciju Mmp2 i Mmp9 značajno su smanjeni u teratomima formiranim Smf3- / - ESC-transduciranim Rif1 shRNA u usporedbi s teratomima stvorenim kontrolnim Smad3 - / - ESCs (slika 6d). Bojenje teratoma antitijelom proliferacijskog staničnog nuklearnog antigena (PCNA) pokazalo je da teratomi formirani Smad3 / / - ESC sadrže više PCNA pozitivnih stanica nego WT ESC i Rif1 shRNA-transducirane teratome nastale Smad3 - / - ESC (slike 6e i f), Zbirno , ovi rezultati pokazali su da je regulacija Rif1 jedan od glavnih čimbenika transformacije Smad3 - / - ESC.

Rasprava

U ovom istraživanju otkrili smo da Rif1, faktor koji sudjeluje u genomskoj stabilnosti, strogo regulira Oct4 i Smad3 u mišjim ESC-ima. Oct4 regrutira Smad3 za promotora Rif1 i olakšava učitavanje PRC2. Da bi održao Rif1 ekspresiju na odgovarajućoj razini u ESC-ima, Oct4 aktivira Rif1 izraz, ali Smad3 je uključen u njegovo potiskivanje (Slika 7). Mullen i sur. izvijestili su da Nanog, Oct4 i Sox2 tvore kompleks i imaju tendenciju ko-povezivanja sa Smad3 na mnogim genima. Iz ChIP-seq podataka iz njihova izvješća otkrili smo da se Nanog, Oct4 i Sox2 svi vežu za SBE Rif1. 4 Vjerojatno je da Rif1 sinergijski regulira ove temeljne faktore transkripcije u ESC-u. Iz prošlih izvješća i naših vlastitih studija čini se vrlo važnim da se Rif1 izrazi na prikladnoj razini za održavanje pluripotencije i stabilnosti ESC-a. Niska razina Rif1 dovodi do diferencijacije mESC-a. 35 Međutim, visoka razina Rif1 je štetna i za ESC-ove vođenjem maligne transformacije Smad3 - / - ESC-a. Usporedba ekspresije Smad3 i Rif1 između stanica teratoma i staničnih linija teratokarcinoma F9 i P19 otkrila je da je Smad3 u teratokarcinomskim stanicama značajno niži od stanica teratoma, dok je Rif1 značajno veći u stanicama teratokarcinoma u odnosu na stanice teratoma (Dopunske slike S7A i S7B). Ovi podaci podržavaju naša otkrića i ukazuju na to da poremećaj u ekspresiji Smad3 i Rif1 može biti jedan od osnovnih mehanizama nastanka teratokarcinoma.

Image

Model za Rif1 regulaciju i rad u ESC-ima

Slika pune veličine

Izvještava se da Rif1 kolokalizira s dvostrukim razbijanjem DNA (DSB) i sudjeluje u popravljanju DNK. 48 Nedavna istraživanja otkrila su da Rif1 doprinosi inhibiciji 5-krajnje resekcije DSB-a, što je prvi korak homologne rekombinacije (HR). Kao rezultat toga, NHEJ promovira popravak DNK sklonog pogreškama uz prisustvo Rif1. U nedostatku Rif1, razina pogrešno povezanih kromosoma značajno se smanjuje. 20, 21, 23, 49 NHEJ dovodi do više kromatinskih nestabilnosti, poput brisanja, translokacija i pojačanja, nego HR. Kromatinska nestabilnost usko je povezana s nastajanjem stanica karcinoma jer omogućava brzi razvoj staničnih subklona koji pokazuju pojačanu proliferaciju, migraciju i otpornost na liječenje lijekovima. 50 Zbog važne uloge Rif1 u NHEJ-u, nije iznenađujuće da djeluje kao anti-apoptosis faktor i povezan je s stvaranjem tumora. 51, 52, 53 Razina Rif1 značajno se povećava u stanicama raka dojke, a iscrpljivanje Rif1 čini ih osjetljivijim na liječenje lijekovima. 51 Ovdje smo primijetili da je Rif1 visoko reguliran u Smad3 - / - ESC-ima, koji također prihvaćaju neka svojstva slična stanicama raka. Poništavanje Rif1 dovodi do poboljšanog popravljanja DNK, najvjerojatnije kroz NHEJ. Prema tome, kromatin Smad3 - / - ESC-a može biti nestabilniji od WT ESC-a, a obaranje Rif1 u Smad3 - / - ESC može samo usporiti tempo stanica od evolucije u više malignih stanica. Otkriveno je da iscrpljivanje Rif1 može osjetiti stanice raka na liječenje lijekovima s pojačanom apoptozom. 51 Nedavna studija otkrila je da je Rif1 važan u održavanju stabilnosti telomera u ESC-ima jer može potisnuti Zscan4, što može potaknuti hiper-telomere izduženje i staničnu staroscenciju od povišene ekspresije. 18 Zanimljivo je da su Rif1 shRNA-transducirani Smad3 - / - ESC-i formirali manje teratome od WT i Smad3 - / - ESC-a. To bi moglo biti zbog toga što stalna ekspresija shRNA Rif1 izaziva apoptozu i starenje stanica. Na temelju ovih rezultata vrijedno je istražiti može li kontrola razine Rif1 u lijekovima imati koristi od liječenja teratokarcinoma.

Materijali i metode

Stanična kultura i diferencijacija

Izvođenje WT i Smad3 - / - mišjih ESC-a opisano je u prethodnim izvješćima. 12, 54 ESC-ovi su održavani na hranilicama ispod uobičajenog ESC medija, koji je sastavljen od DMEM s visokom glukozom (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) i 15% ES kulture kulture FBS (Gibco), 0, 1 mM nebitne aminokiseline (NEAA; Gibco), 0, 1 mM 2-merkaptoetanol (Gibco), 2 mM glutamina (Gibco), 100 U / ml penicilina i streptomicina (Gibco) i 1000 U / ml LIF (Millipore, Billerica, MA, SAD). Da bi se dobile ESC linije bez punjenja, ESC-ovi su pasirani 2–3 puta da bi se potpuno dobili oslobodili od dovodnih stanica i uzgajani na 0, 2% želatinoznoj oblozi u ES mediju koji sadrži LIF i 2i (1 µM PD325901 i 3 µM CHIR99021).

Za pokus diferencijacije ESC-om, uklonjeni su 2i i LIF i dodan je 1 µM retinoične kiseline (RA) u kulturni medij da se inducira ESC diferencijacija. Za ispitivanje formiranja EB, jednoslojni nediferencirani WT ESC-i i Smad3 - / - ESC-i bili su tripsinizirani u pojedinačne stanice, te potom sjeme, u gustoći od 1 × 106 stanica / 10 ml, u 10 cm neprlijepljenu posudu u ESC kulturnom mediju lišen 2i i LIF-a. Medij za kulturu mijenjao se svaka 2 dana, a EB-ovi prikupljeni 2., 4., 6., 8. i 10. dan.

Konstrukcije plazme

Dvije konstrukcije shRNA koje ciljaju Rif1 stvorene su prema prethodnim izvještajima s pSuper.puro vektorom (Addgene, Cambridge, MA, SAD). 35 Da bi se stvorio lentivirusni vektor za ekspresnu shRNA pomoću lentivirusa, Rifl shRNA sekvence zajedno s H1 promotorom izrezane su iz pSuper plazmida s EcoRI i ClaI i sub-klonirane na pLVTH plazmid. Kako bi se konstruirao Rif1 promotorski izvještajni plazmid, fragment od 2000 bp, koji obuhvaća mjesta koja vežu Smad3, pojačan je primerima iz genomske DNK mišjih ESC-a i kloniran u pGL3 vektor (Promega, Madison, WI, USA) u Mlu I i mjesta Xho I. Da bi se konstruisali plazmidi pCAG- GFP , pCAG- Smad3 i pCAG- Pou5f1 , ORF sekvence ovih gena su amplificirane iz cDNA mišjih ESC-a, digestirane i ubačene u pCAG-flag-vektor (Addgene) na Bgl II- Xho I ( GFP i Smad3 ) i mjesta Mlu I- Xho I ( Pou5f1 ). Svi amplifikacijski primeri su dodani u Tablicu 1 i ti rekombinantni vektori su sekvencionirani.

Tablica pune veličine

PCR test u stvarnom vremenu

PCR analiza u stvarnom vremenu provedena je korištenjem analize ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) stroja s SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, Shiga, Japan) prema uputama proizvođača. Ciklusne ( C T ) vrijednosti ciljnih gena prvo su normalizirane prema C T vrijednosti unutarnje kontrole ( Actin gen), a zatim su normalizirane na C T vrijednost odgovarajućih transkripata kontrolnog uzorka. Sekvence prajmera DNK korištene za PCR test u stvarnom vremenu navedene su u Tablici 1. Za svaki par pramera detektiran je samo jedan raspon ispravne veličine i jedan vrh. Svi PCR testovi u stvarnom vremenu sadržavali su trostruke podatke s uzorcima iz tri neovisna eksperimenta.

Western blot

WT i Smad3 - / - ESC sakupljeni su s puferom za liziranje proteina RIPA koji sadrži 0, 2 M NaCl, 1% SDS, 1 mM PMSF inhibitor i 0, 1 M DTT. Zatim se SDS-PAGE koristi za odvajanje proteina. Nakon odvajanja, proteini su preneseni na PVDF membrane (Pall Corporation, Port Washington, NY, USA). Nakon toga, PVDF membrane su blokirane u 5% nemasnom mlijeku (BD Company, Franklin Lakes, NJ, USA) u TBS-u, sa 0, 1% Tween-20, 1 sat na sobnoj temperaturi, i inkubirane s primarnim antitijelom u TBS + 0, 1% Tween- 20 preko noći na 4 ° C. Primarna protutijela i omjeri razrjeđivanja bili su sljedeći: Miševi anti-Gapdh (A-3) (sc-137179; Biotehnologija Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornija, SAD) korišteni u 1/2000; Zečje anti-Smad3 antitijelo (06–920, Upstate, Billerica, MA, SAD) korišteno u 1/1000; Koza anti-Oct3 / 4 (N-19) (sc-8628; Santa Cruz Biotechnology) koja se koristi u 1/2000; Rif1 antitijelo (dobiveno od Ian R Adams) korišteno u razrjeđivanju 1/1000; Antitijelo protiv proteina A (Ab-2) (RPA34-19) (Millipore) korišteno u koncentraciji od 5 µg / ml; i Rabbit anti-pH2AX (Ser139, # 2577), anti-pChk1 (Ser345, # 2348) i anti-pChk2 (Thr68, # 2661; Cell Signaling Technology, Denver, MA, SAD) koji se koriste pri razrjeđivanju 1/1000. After blotting with the primary antibody, the PVDF membranes were washed with TBS+0.1% Tween 205 times, for 10 min each, and then blotted with the proper secondary antibodies. The secondary antibodies were anti-mouse immunoglobulin G (IgG)-HRP (Sant Cruz Biotechnology; Sc-2314) and anti-Rabbit IgG-HRP (GE Healthcare Life Sciences Dako, Piscataway, NJ, USA) at 1/10000 dilutions for both. Eventually, the signals were tested using ECL detection reagents (Abcam, Cambridge, UK).

microarray

Total RNAs of WT ESCs and Smad3−/− cells were extracted using Trizol (Invitrogen, Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. Ten μg of total RNAs was aliquoted and digested with DNAse (New England Biolaboratory, Ipswich, MA, USA) at 37 °C for 45 min to remove DNA contamination, and then the RNA samples were purified with a RNeasy mini-kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Subsequently, the purified RNAs were transferred for reverse transcription, labeled and hybridized to an Affymetrix mouse exon 1.0 ST Array (Santa Clara, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. The array data were analyzed using Partek Inc (St. Louis, MO, USA) and Genespring software (Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA, USA). The threshold for gene expression was 1.5-fold. The expression level of genes larger than 1.5-fold (up or down) were picked out to draw the heat map. The GEO access number for the microarray data is GSE57995.

ChIP test

A ChIP assay for mouse ESCs was carried out as described previously. 55 Briefly, 1% (w/v) formaldehyde was added to 3 × 10 7 cells and incubated at room temperature for 10 min, then inactivated by adding 125 mM glycine for 5 min. The cells were then lysed and the chromatin fragmented by a Bioruptor Sonicator (Bioruptor UCD-200, Diagenode Company, Liège, Belgium) to a size around 500 bp. Soluble chromatins were incubated at 4 °C overnight with a Dynabead (Invitrogen) coupled anti-Smad3 antibody (06–920, Upstate), anti-Oct3/4 (N-19) (sc-8628; Santa Cruz Biotechnology), anti-H3K9Me2 antibody (Milipore), anti-H3K9Me3 antibody (Milipore), anti-H3K4Me3 antibody (Abcam), anti-H3K27Me3 antibody (Milipore), anti-SUZ12 antibody (Abcam) or a corresponding control IgG (Milipore). The antibody-enriched DNAs were decrosslinked and purified with phenol–chloroform (Ambion, Applied Biosystems), followed by ethanol precipitation. The precipitated DNA was dissolved in TE buffer and analyzed by real-time PCR using the ABI Prism 7900HT sequence detection system and SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa). Fold enrichments of the enriched DNA were calculated according to ratios of the immunoprecipitated DNA to the input samples and then normalized against the DNA level at control regions. All the DNA primer sequences used for the ChIP-qPCR assay are listed in Table 1. For each pair of the primer, only one correct size band and one peak were detected. All the real-time PCR assays comprised triplicate data with samples from three independent experiments.

Analiza luciferaze

For luciferase assay, the Renilla plasmid (5 ng per well) was used as the internal transfection control, whereas the pGL3 empty vector (100 ng per well) was used as the experimental control. Lipfectamine 2000 (Invitrogen) was used to conduct transfection experiments following the manufacturer's instructions. Forty-eight hours after transfection, luciferase activity was detected using a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) according to the manufacturer's instructions. Transfection of each pGL3 construct was performed in triplicate in each assay and a total of three independent experiments were performed. Empty vector (pGL3) was transfected to both WT and Smad3−/− ESCs in triplicate for normalization. The luciferase readings were recorded and ratios of Renilla luciferase readings to firefly luciferase readings were recorded for each experiment and triplicate data averaged. The average values of the tested constructs were normalized to the activity of the pGL3 empty construct and the Renilla activity. The error bar represents mean±SD ( n =3).

AP stain

WT and Smad3−/− ESCs were washed with DPBS buffer (Dulbecco's phosphate-buffered saline, Invitrogen) and fixed with a solution containing 90% methanol and 10% formaldehyde for 20 min at room temperature. The ESC samples were then washed with DPBS buffer three times, each for 3 min. Subsequently, the ESCs were incubated for 15 min in the dark chamber at room temperature with an AP staining solution composed of solution A (0.4 mg/ml Fast Red Violet LB Base solution, Sigma), solution B (4 mg/ml Napthol AS-BI phosphate solution, Sigma) and water, in a ratio of 2 : 1 : 3, according to the manufacturer's instructions. Finally, the ESC samples were washed with DPBS buffer three times, each for 3 min, and photographed with an Olympus microscope (FV1000, Olympus, Tokyo, Japan).

BrdU integration and flow cytometry analysis

3 × 10 5 WT ESCs and Smad3−/− ESCs, respectively, were seeded on six-well plates in an ESC culture medium for 2 days and then incubated in a serum-free ESC culture medium for one night. The next morning, the medium was replaced with a thin layer of PBS buffer and the cells were irradiated with UV (40 mJ cm −2 ) using UV Stratalinker 2400 (Stratagene Company, Oceanside, CA, USA). After UV irradiation, the cells were cultured in normal conditions (37 °C and 5% CO 2 ) for another 3 h in ESC culture medium containing serum. Thirty minutes before collecting the samples, then BrdU (10 μ M) was added in the medium for pulse integration. The WT ESCs and Smad3−/− ESCs were then digested with 0.25% EDTA-trypsin to obtain single cells, which were subsequently fixed in cold 70% ethanol, overnight at 4 °C. To remove RNA contamination, WT and Smad3−/− ESC samples were treated with 100 μ g/ml RNAse (Sigma) for 30 min at 37 °C. Next, the cells were stained with the Alexa Fluor 488 conjugate anti-BrdU mouse monoclonal antibody (1 : 100, Invitrogen) for 1 h at room temperature. Eventually, the cells were washed with PBS and stained with 20 μ g/ml PI solution (Sigma) at 37 °C for 1 h in a dark room. Flow cytometric analysis was performed on 10, 000 gated events using a FACS Calubur (BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). The software used to analyze the phase distribution of the cell cycle was FCS Express V3 (De Novo Software Company, Los Angeles, CA, USA). The cell distribution ratio data were collected and analyzed. All the data were duplicated.

Wound-healing assay and transwell assay

4 × 10 5 WT and Smad3−/− ESCs were seeded in six-well tissue culture plates, respectively, in 2i and LIF ESC culture media. After 2 days, the ESC media were changed to differentiation media, in which 2i and LIF were removed and 1 μ M RA (Sigma) was added, for another day to promote quick ESC differentiation. When ESCs were completely differentiated into monolayer cells, autoclaved yellow pipette tips were used to generate scratches. After scratching, the detached cells were removed by washing twice with DPBS buffer, and then cultured in differentiation media for another 24 h under normal condition. Images were taken by a Zeiss microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany) and analyzed, using Image J software (NIH, Washington, DC, USA), at 0 and 24 h. Triplicate independent assays were performed. The cell invasive assay was performed using the CytoSelect 24-Well Cell Invasion Assay Kit (Cat # CBA-110-COL, Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

AP

alkaline phosphatase

bankomat

ataxia telangiectasia mutated

ATR

ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related protein

BrdU

bromodeoxyuridine

Ccnd2

cyclin-D2

Čip

kromatinska imunoprecipitacija

EB

embryoid body

ESC

embryonic stem cell

HR

homologous recombination

IgG

imunoglobulin G

LIF

inhibitor leukemije

MEF

mouse embryonic fibroblast

NHEJ

nehomologno krajnje spajanje

PCNA

umnožavanje staničnog nuklearnog antigena

PI

propidium iodide

RA

retinoic acid

Rif1

RAP1-associated protein 1

RPA

replication protein A

shRNA

kratka ukosnica RNA

Smad3

SMAD family member 3

TGF- β

transforming growth factor beta

UV

ultraljubičast

WT

divlji tip

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)