Tnf-inducirana nekroptoza u 1929 stanicama je čvrsto regulirana od strane više tnfr1 kompleksa i i ii članova | stanična smrt i bolest

Tnf-inducirana nekroptoza u 1929 stanicama je čvrsto regulirana od strane više tnfr1 kompleksa i i ii članova | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Necroptosis
  • NF-kB
  • Čimbenici tumorske nekroze

Sažetak

Signalizacija TNF receptora 1 inducira NF- κ B aktivaciju i nekroptozu u L929 stanicama. Prethodno smo izvijestili da stanični inhibitor ubikvitacije proteina 1 (RIP1) koji posreduje protein apoptoze djeluje kao citoprotektivni mehanizam, dok propadanje cilindromatoze, enzima deubikvitacijskog RIP1, štiti od nekroptoze izazvane faktorom tumorske nekroze (TNF). Ovdje izvješćujemo da je RIP1 ključni posrednik kanonične NF -κ B aktivacije u stanicama L929, stoga dovodi u pitanje relativni citoprotektivni doprinos ubikvitacije RIP1 u odnosu na kanonsku NF- κ B aktivaciju. Otkrili smo da atenuirana aktivacija NF-B B nema utjecaja na nekroptozu uzrokovanu TNF-om. Međutim, identificirali smo kompleks sklopa lančanih ubikvitina A20 kao negativne regulatore nekroptoze. Neočekivano, za razliku od RIP3, ustanovili smo i da obaranje RIP1 ne blokira citotoksičnost TNF-a. Tipiziranje stanične smrti otkrilo je da stanice sa osiromašenim RIP1 prelaze s nekroptotske u apoptotsku smrt, što ukazuje da RIP1 također može suzbiti apoptozu u L929 stanicama. Suprotno tome, opazili smo da protein povezan s Fasom preko domene smrti, stanični protein inhibicijski FLICE i kaspaza-8, koji su svi uključeni u pokretanje apoptoze, djeluju protiv indukcije nekroptoze. Napokon, izvještavamo i o RIP1 neovisnoj ali RIP3 posredovanoj nekroptozi u kontekstu TNF signalizacije u određenim uvjetima.

Glavni

Faktor nekroze tumora (TNF) je pleiotropni citokin koji veže i aktivira TNF receptore 1 i 2 (TNFR1 i TNFR2). U većini tipova stanica, signalizacija TNFR1 pospješuje preživljavanje stanica aktivirajući ekspresiju gena za preživljavanje aktiviranjem kanonskog NF- κ B puta. Međutim, kada se inhibira sinteza proteina, aktiviranje TNFR1 pretvara se u signal smrti. 1 Nakon aktiviranja, TNFR1 trimeri prolaze konformacijsku promjenu koja omogućava da citosolni dio receptora regrutuje domenu smrti (TRADD) povezanu sa TNFR-om, protein 1 koji utječe na receptor (RIP1) i faktor 2 povezan s TNFR (TRAF2). 2, 3 TRAF2 se nakon toga veže na stanični inhibitor proteina apoptoze 1 i 2 (cIAP1 / 2), koji omogućuju regrutaciju kompleksa linearnog ubikvitina lančanog sklopa (LUBAC) da bi se konačno stvorio membranski proksimalni supramolekularni ustroj koji se naziva TNFR1 kompleks I ( TNFR1-Cl). 4 Unutar ovog složenog nerazgradljivog lanca polubikvitina konjugiran je cIAP1 / 2 (Bertrand i dr. 5 ) na RIP1, a navedeni lanci prijavljeni su da služe kao skele za regrutaciju i aktiviranje TAB-transformirajućeg faktora rasta- β- aktiviranog faktora kompleks kinaze 1 (TAK1) i inhibitor kompleksa esencijalnog modulatora (NEMO) α -IKK β –NF- κ B (NEMO), što rezultira aktivacijom NF- κ B i transkripcijskom uregulacijom gena za preživljavanje. 6, 7 Nedavno istraživanje koje je koristilo stanice s nedostatkom RIP1 dovodilo je u pitanje uobičajeno mišljenje da je RIP1 apsolutno potreban za aktiviranje NF-B B izazvanog TNF-om, sugerirajući da i drugi sveprisutni proteini unutar kompleksa mogu regrutovati i aktivirati TAB-TAK1 i kompleksi IKK α –IKK β –NEMO. 8

Nakon internalizacije ligand-vezanog TNFR1, molekulski sastav TNFR1-CI se mijenja i pokreće stvaranje signalnog kompleksa citosolne smrti koji je poznatiji kao TNFR1 kompleks II (TNFR1-CII). 3 RIP1 poliubikvitacija ne samo da utječe na aktivaciju NF- κ B, nego također utječe na prijelaz iz TNFR1-CI u TNFR1-CII. 5, 9, 10 Nakon deubikvitacije RIP1 cilindromatozom (CYLD), 11 RIP1 se regrutuje za supramolekularne komplekse koji uključuju najmanje TRADD, protein povezan s Fasom sa domenom smrti (FADD), RIP1, RIP3 i kaspazu-8. 3, 12 Ostaje nejasno da li i drugi RIP1-deubikvitinirajući enzimi kao što je A20 također stimuliraju smrtonosne funkcije RIP1. U TNFR1-CII, kaspaza-8 inaktivira RIP1 i RIP3 proteolitičkim cijepanjem i pokreće kaskadu pro-apoptotske aktivacije kaspaze. 12, 13 Aktivacija i oslobađanje kaspaze-8 kontrolira se stanični FLICE inhibitorni protein (c-FLIP). 14

Suprotno tome, kada se kaspaza-8 izbriše, osiromaši ili inhibira CrmA ili farmakološkim agensima, TNFR1-CII ne može ući u nekroptozu 'apoptotičkog načina' i rezultata ligacije TNFR1 (barem u nekim tipovima stanica). 15, 16, 17 Ovi nalazi potcrtavaju se opažanjem da je embrionalna smrtonosnost miševa s nedostatkom kaspaze-8 spašena brisanjem RIP3. 17, 18 Da li je FADD ili TRADD strogo potrebno za sastavljanje signalnog kompleksa nekroptoze ili "nekrosoma", još uvijek je kontroverzno. 15 U korist anti nekrotičke funkcije za FADD je zapažanje da miševi s nedostatkom FADD pokazuju masivnu nekrozu, sadrže povišene razine ekspresije RIP1, embrionalno su smrtonosne i mogu ih se spasiti brisanjem RIP1. 19 I RIP1 i RIP3 kinazne aktivnosti ključne su za nekroptozu uzrokovanu TNF-om, 20 ali molekularni mehanizmi koji reguliraju ovu vrstu stanične smrti još uvijek su enigmatični. Donedavno je nekroza bila, za razliku od apoptoze, definirana kao slučajna i nekontrolirana vrsta umiranja stanica. Izraz 'nekroptoza' prvotno je uveden da označava reguliranu nekrozu 21, ali kasnije je utvrđeno da ovisi o RIP1. 22 Međutim, nekroza ovisna o RIP3 također se može odvijati bez potrebe za RIP1. Zapravo, zabilježeno je da prekomjerna ekspresija ili virusna infekcija RIP-om mogu izazvati nekrozu nezavisno od RIP1. 23, 24 Stoga je Odbor za nomenklaturu za staničnu smrt predložio da se 'nekroptoza' može upotrijebiti za označavanje RIP1 i / ili RIP3 ovisne regulirane nekroze. 25 Razumijevanje regulacije nekroptoze ključni je prioritet, posebno u svjetlu nedavnih in vivo studija koje su izvjestile o važnosti nekroptoze u nekoliko patoloških stanja. 20 Stanična linija mišjeg fibrosarkoma L929 dobro je utvrđen stanični model za proučavanje nekroptoze. U ovim ćelijama signalizacija TNFR1 inducira NF- κ B aktivaciju i nekroptozu u odsutnosti kaspaze ili inhibitora sinteze proteina. 16 Koristeći ovaj model, prethodno smo izvijestili o citoprotektivnoj ulozi za cIAP1 i TAK1 u nekroptozi uzrokovanoj TNF-om. 26 Naši rezultati pokazali su da ubikvitacija RIP1 posredovana s CIAP1 djeluje kao glavni zaštitni mehanizam protiv stvaranja nekrosoma. Dosljedno tome, mi i drugi otkrili smo da suzbijajući CYLD, RIP1-deubikvitinirajući enzim, štiti L929 stanice od nekroptoze izazvane TNF-om. 26, 27

U ovom istraživanju otkrili smo da je RIP1 ključni posrednik kanonične NF- κ B aktivacije u stanicama L929, stoga smo doveli u pitanje relativni doprinos ubikvitacije RIP1 u odnosu na kanoničnu NF- κ B aktivaciju kao citoprotektivni događaji protiv nekroptoze izazvane TNF-om. Da bismo odgovorili na to pitanje, istraživali smo ulogu ostalih komponenti TNFR1-CI u našem nekroptotskom staničnom modelu. Zanimljivo je da smo otkrili da slabljenje NF- κ B aktivacije ne utječe na nekroptozu izazvanu TNF-om, što nas je dovelo do identifikacije neočekivane regulatorne uloge A20, drugog enzima RIP1-deubikvitinirajućih tvari i za LUBAC u indukciji nekroptoze. U svjetlu još uvijek kontroverznog doprinosa članova TNFR1-CII rezultatima ćelijske smrti, istražili smo njihovu ulogu u odluci o modalitetu ćelije, iscrpljujući ih. Ovaj pristup je otkrio da FADD, c-FLIP L i kaspaza-8, koji su svi uključeni u pokretanje apoptoze, djeluju suprotno indukciji nekroptoze. Pored toga, otkrili smo da represija RIP1, ali ne RIP3, inducira prelazak s nekroptoze izazvane TNF-om u apoptozu posredovanu TNF-om, što ukazuje da RIP1 suzbija apoptozu u ovom staničnom sustavu. Konačno, također izvještavamo o RIP1 neovisnoj, ali RIP3 ovisnoj nekroptozi u kontekstu TNF signalizacije u L929 stanicama.

Rezultati

Propadanje reguliranog proteina 2 hemiksidacijskog željeza 2 ubikvitin ligaza-1 (HOIL-1), protein koji utječe na HOIL-1 (HOIP) ili A20 senzibilizira stanice na nekroptozu izazvanu TNF-om, dok iscrpljivanje TRADD ili NEMO ne utječe na održivost stanica

Za razliku od situacije koja se opaža u većini tipova stanica, TNFR1 signalizacija u mišjoj L929 fibrosarkom staničnoj liniji aktivira NF- κ B i također inducira staničnu smrt (nekroptoza), u odsutnosti sintetskih kaspaza ili inhibitora sinteze proteina. 16 Koristeći ovaj stanični sustav, ranije smo izvijestili da iscrpljivanje cIAP-a dovodi do stvaranja nekrosomskih kompleksa i snažno je senzibiliziralo stanice na nekroptozu uzrokovanu TNF-om. 26 Zanimljivo je da sada pružamo podatke koji pokazuju da suzbijanje razine RIP1 od strane RNAi gotovo u potpunosti inhibira razgradnju I κ B α posredovanu TNF-om u stanicama L929 (slika 1a), što ukazuje da je RIP1 glavni regulator aktiviranja NF- κ B izazvanog TNF-om u tim ćelijama. Unutar TNFR1-CI, ubikvitacija RIP1 posredovana cIAP-om je važna kako bi se spriječilo da se RIP1 integrira u TNFR1-CII koji izaziva smrt. Pored toga, konjugacija nerazgradljivih lanaca ubikvitina na RIP1 važan je za aktivaciju NF-B B, još jedan citoprotektivni događaj. Da bismo istražili doprinos svakog procesa prevenciji stanične smrti, analizirali smo utjecaj proteina koji iscrpljuju sudjeluju u regulaciji svakog citoprotektivnog procesa na nekroptozi uzrokovanoj TNF-om. Svi TRADD, 28, 29, NEMO 30 i LUBAC (HOIL-1 i HOIP) 4, 31 prijavljeni su kao važni pozitivni regulatori aktiviranja NF- κ B posredovanog TNF-om i otkrili smo da potiskivanje svakog od tih proteina RNAi dovodi do približno slična inhibicija razgradnje I κ B α nakon stimulacije TNF-om u stanicama L929 (dopunska slika 1a). Zanimljivo je da ušutkavanje NEMO-a i TRADD-a nije imalo utjecaja na nekroptozu posredovanu TNF-om (Slike 1b i c). Suprotno tome, potiskivanje LUBAC-ove komponente HOIL-1 ili HOIP pojačano TNF-induciranom staničnom smrću (slika 1d), što ukazuje da osjetljivost na smrt nakon pada LUBAC-a ne ovisi o aktivaciji NF- κ B. Međutim, treba napomenuti da je obustava HOIP snažnija u promicanju smrti uzrokovane TNF-om u odnosu na prigušivanje HOIL-1 (slika 1e). Da bismo odredili vrstu ćelijske smrti u ovim senzibiliziranim uvjetima nakon rušenja HOIL-1 ili HOIP, stabilno smo transfektirali konstrukciju senzora apoptoze na bazi Förster-rezonancije (FRET) u stanice L929 da otkrijemo aktivnost kaspaze-3, u daljnjem tekstu L929pCasper3 -BG stanice. U tim ćelijama prigušivanje HOIL-1 ili HOIP povećava količinu ćelijske smrti (dopunska slika 2a) bez ikakvih aktivnosti kaspaze-3 (dopunska slika 2b), što ukazuje da pojačani tip smrti ne nastaje zbog prelaska na apoptozu. CYLD je enzim za devbikvitiniranje RIP1, a mi i drugi smo prethodno pokazali da represija CYLD štiti L929 stanice od nekroptoze izazvane TNF-om, 26, 27 što je u skladu s citoprotektivnom ulogom nerazgradive ubikvitacije RIP1. A20 je još jedan RIP1-deubikvitinirajući enzim za koji se javlja da negativno regulira TNF-induciranu NF- κ B aktivaciju. 32 Očekivalo se da će represija A20 zaštititi stanice od nekroptoze izazvane TNF-om. Umjesto toga, bili smo iznenađeni kada smo otkrili da iscrpljivanje A20 ima suprotan učinak i uvelike je senzibiliziralo stanice do smrti (slike 1f i g). Izvođenjem ovog eksperimenta u L929pCasper3-BG stanicama pokazalo je da prigušivanje A20 pojačava smrt stanica (dopunska slika 2c) u nedostatku bilo koje aktivnosti kaspaze-3 nakon stimulacije TNF-om (dopunska slika 2d). Važno je napomenuti da je ova osjetljivost također neovisna o NF- κ B, jer iscrpljivanje A20 nije inhibiralo ranu aktivaciju NF- κ B (dopunska slika 1b). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da NF-κB aktivacija nema glavnu zaštitnu ulogu protiv nekroptoze izazvane TNF-om u stanicama L929. Pored toga, identificirali smo LUBAC-ove komponente HOIL-1 i HOIP, kao i deubikvitinazu A20, kao negativne regulatore nekroptoze posredovane TNF-om.

Image

Propadanje HOIL-1, HOIP ili A20 senzibilizira nekroptozu izazvanu TNF-om, dok iscrpljivanje TRADD ili NEMO ne utječe na održivost stanica. ( a ) Nakon rušenja RIP1, stanice L929 stimulirane su TNF-om naznačeno vrijeme. Degradacija I κ B α i destrukcija RIP1 analizirani su korištenjem Western blottinga. Zvezdica označava nespecifičan pojas. Protjecite citometrijsku analizu postotka Sytox-pozitivnih stanica nakon stimulacije TNF-om u trajanju od 4 h (dostižući oko 50% stanične smrti u kontrolnoj postavi) L929 stanica u kojima su TRADD ili NEMO ( b ), HOIL-1 ili HOIP ( d ), ili A20 je srušen ( f ). Trake pogrešaka pokazuju SD trostruke tri neovisne eksperimente. Analiza preživljavanja stanica pomoću MTT testa nakon 20 h TNF stimulacije L929 stanica u kojima su srušeni TRADD ili NEMO ( c ), HOIL-1 ili HOIP ( e ), ili A20 ( g ). Trake pogrešaka pokazuju S.Ds trojki. Efikasnost zaustavljanja navedenih proteina određena je Western blottingom ili RT-PCR-om. * P <0, 05 (Mann-Whitney U- test)

Slika pune veličine

Propadanje FADD, kaspaza-8 ili c-FLIP osjetljivosti na nekroptozu uzrokovanu TNF-om

Nakon stimulacije TNF-om, deubikvitacija RIP1 omogućava formiranje citosolne smrti koja izaziva smrt TNFR1-CII. 3. Ovaj kompleks, koji se sastoji od najmanje TRADD, FADD, kaspaze-8, RIP1 i RIP3, omogućava indukciju apoptoze ili nekroptoze, ovisno o staničnoj situaciji. 20 Kako bismo testirali zahtjev za tim proteinima u nekroptozi uzrokovanoj TNF-om u stanicama L929, usmjerili smo ih prema RNAi. Pripadanje FADD-a ili kaspaze-8 snažno je poboljšalo staničnu smrt uzrokovanu TNF-om kao funkciju vremena (slike 2a i b) i senzibilizirano umiranje stanica uzrokovano TNF-om 30 puta na temelju IC50 vrijednosti (slike 2a i c). U L929pCasper3-BG stanicama, obustava kaspaze-8 povećala je količinu stanične smrti (dopunska slika 3a) nakon TNF stimulacije bez pokazivanja bilo kakve aktivnosti kaspaze-3 (dopunska slika 3b). Pored toga, povećana količina stanične smrti nakon propadanja kaspaze-8 i liječenja TNF-om snažno je smanjena u prisutnosti inhibitora RIP1 kinaze nekrostatin-1 (Nec-1) (dopunska slika 3a). Zajedno, ovi podaci pokazuju da prigušivanje senzibilizacije kaspaza-8 stanica L929 na TNF-induciranu nekroptozu te se slažu s drugim studijama koje prijavljuju negativnu regulatornu ulogu kaspaze-8 u nekroptozi u Jurkatu i primarnim T stanicama 33 te benziloksikarbonil-Val- Ala-Asp (OMe) -fluorometilketon (zVAD) -fmk-inducirana smrt RIP3 ovisna u stanicama L929. 17 Zanimljivo je da je regulacija c-FLIP-a, regulatora aktivacije kaspaze-8, 17 također snažno poboljšana (Slika 2b) i senzibilizirana stanična smrt 10-puta više na TNF stimulaciju (Slika 2c). Zaključili smo da bi smanjena regulacija c-FLIP-a dovela do povećanog stvaranja aktivnih dimera kaspaze-8 unutar TNFR1-CII i izazvala prelazak na apoptotsku staničnu smrt. Međutim, upotreba senzora za apoptozu zasnovanu na FRET-u otkrila je da su L929p Casper3-BG stanice osiromašene c-FLIP-om i dalje uginule na način nezavisan od kaspaze kada su bile izložene TNF-u (dopunske slike 4a i b), čime je potvrđeno ispitivanje Obersta i sur. Slika 17 pokazuje da u L929 stanicama c-FLIP prigušivanje potiče zVAD-fmk-induciranu smrt stanica o kojoj ovisi RIP3. Slika živih stanica TNF-a tretiranih stanica potvrdila je nekrotičnu morfologiju (dopunska slika 4c) ovih osjetljivih stanica. Suprotno tome, naša kontrola, koja se sastojala od apoptoze posredovane Fas receptorima, pokazala je pojačanu apoptozu nakon što je srušen c-FLIP (dopunske slike 4a i b). Zajedno s prethodnim rezultatima, ovi podaci ukazuju da adapter proteini TRADD i FADD očito imaju različite uloge u nekroptozi uzrokovanoj TNFR1. Dok je TRADD neophodan za nekroptozu izazvanu TNF-om, ključne molekule apoptotske osi, FADD, kaspaza-8 i c-FLIP djeluju protiv nekroptoze izazvane TNF-om.

Image

FADD, kaspaza-8 ili c-FLIP knockdown senzibilizira nekroptozu uzrokovanu TNF-om. ( a ) Protječite citometrijsku analizu postotka Sytox-pozitivnih stanica nakon 3 sata TNF stimulacije (dostizanje oko 25% smrtnosti stanice u kontrolnoj postavi) i analizu preživljavanja stanica pomoću MTT testa nakon 20 h TNF stimulacije L929 stanica u kojima FADD je srušen. ( b ) protočna citometrijska analiza postotka Sytox-pozitivnih stanica nakon 3 sata TNF stimulacije stanica L929 u kojima je srušen kaspaza-8 ili c-FLIP. Trake pogrešaka označavaju SD trostrane najmanje dva neovisna eksperimenta. ( c ) Stanična analiza preživljavanja primjenom MTT testa nakon 20 h TNF stimulacije stanica L929 u kojima su srušeni kaspaza-8 ili c-FLIP. Trake pogrešaka ukazuju na S.D-ove trostruke podatke, a podaci su reprezentativni za najmanje tri neovisna eksperimenta. Efikasnost zaustavljanja navedenih proteina određena je Western blottingom ili RT-PCR-om

Slika pune veličine

Rušenje RIP1, ali ne i RIP3, prebacuje TNF-induciranu nekroptozu nezavisnu od TRADD na apoptozu ovisnu o TRADD

RIP1 i RIP3 kinaze imaju presudnu ulogu u nekroptozi izazvanoj TNF-om. 12, 15, 23, 34 Prethodna izvješća pokazala su da je prigušivanje ekspresije RIP3 spasilo L929 stanice od nekroptoze izazvane TNF-om. 12, 23, 26, 34 Iznenađenje, pad RIP1 nije zaštitio L929 stanice od TNF-inducirane stanične smrti (slika 3a). Budući da iscrpljivanje RIP1 blokira nekroptozu uzrokovanu TNF-om u prisutnosti inhibitora pan-kaspaze zVAD-fmk u L929 stanicama, 12, 35, obrazložili smo da bi iscrpljivanje RIP1 moglo dovesti do prelaska na apoptozu. Ova hipoteza naglašava naš prethodni nalaz da je kemijska inhibicija proteina toplotnog udara 90, što rezultira razgradnjom proteina njegovog klijenta, poput RIP1, 36 rezultiralo prelaskom s nekroptozom izazvanom TNF-om u apoptozu. 37 Uporaba senzora za apoptozu zasnovanu na FRET pokazala je da snižavanje razine RIP1 pomoću RNAi doista rezultira brzom indukcijom apoptoze kao odgovora na TNF stimulaciju (slika 3c), što je otkriveno i proteolitičkom aktivacijom kaspaze-3 (slika 3b) i apoptotičkim blebetanjem (Slika 3d). Budući da se TRADD i RIP1 natječu za vezanje za TNFR1, 38 smo zaključili da TRADD doprinosi ovom prebacivanju na apoptozu nakon gubitka RIP1. Zapravo, obustava TRADD blokirala je aktivnost kaspaze izazvanu TNF-om u odsutnosti RIP1 i snažno smanjila staničnu smrt (Slika 3c). Ukratko, ovi podaci pokazuju da iscrpljivanje RIP1 u stanicama L929 rezultira prelaskom s nekroptoze nezavisne od TRADD (slika 1b) u apoptozu ovisnu o TRADD kao odgovor na TNF.

Image

RIP1 knockdown prelazi TNF-induciranu nekroptozu nezavisnu od TRADD u apoptozu ovisnu o TRADD. ( a ) Protjecite citometrijsku analizu postotka Sytox-pozitivnih stanica u naznačenim vremenskim točkama nakon TNF stimulacije L929 ćelija u kojima je srušen RIP1. Učinkovitost smanjenja udara određena je zapadnim upijanjem. ( b ) Western blot analiza obrade kaspaze-3 u naznačenim vremenskim točkama nakon TNF stimulacije stanica L929 u kojima je srušen RIP1. ( c ) protočna citometrijska analiza postotka aktivnosti kaspaze-3 i PI-pozitivnih stanica u naznačenim vremenskim točkama nakon TNF stimulacije ćelija L929pCasper3-BG u kojima su srušeni RIP1 ili RIP1 + TRADD. Učinkovitost zaustavljanja navedenih proteina određena je zapadnim blotiranjem. ( d ) Stanice su obojene s Hoechst 33242 (plava) i PI (crvena) za snimanje živih stanica i praćene 8 h. Prekrivajući snimke fluorescentnih i prenesenih svjetlosnih slika u naznačenim vremenskim točkama nakon TNF stimulacije ćelija L929 u kojima je srušen RIP1. Trake pogrešaka ukazuju na S.D-ove trostruke podatke, a podaci su reprezentativni za najmanje tri neovisna eksperimenta.

Slika pune veličine

RIP3-ovisna nekroptoza nakon rušenja RIP1 i kaspaze-8

Koristeći se sličnim pristupom kao gore, otkrili smo da dvostruko oborenje RIP1 i kaspaza-8 potpuno inhibira kaspozu posredovanu kaspazom na stimulaciju TNF-om bez utjecaja na stupanj stanične smrti (slika 4a), što ukazuje na prelazak na nekrozu nezavisnu od RIP1. Trostruko oboreno otkrivanje otkrilo je da je prigušivanje RIP1, kaspaze-8 i RIP3 rezultiralo potpunom zaštitom, pokazujući da odsutnost RIP1 i kaspaza-8 dovodi do snažne pristranosti prema nekrozi ovisnoj o RIP3 (slika 4a). Slično tome, TNF-inducirana nekroza stanica u kojoj su oboreni i RIP1 i TRADD potpuno je spašena kada je RIP3 također utihnuo (Slika 4b). Zaključujemo da obustava kaspaze-8 u uvjetima s nedostatkom RIP1 jasno sprječava apoptozu izazvanu TNF-om, ali ipak omogućuje regulirani oblik nekroze, koji ovisi isključivo o RIP3. Ovi rezultati pokazuju da se u određenim uvjetima nekroza posredovana TNF-om može pojaviti u odsutnosti RIP1.

Image

Nekroptoza ovisna o RIP3 kada se sruše RIP1 i kaspaza-8 ili TRADD. ( a ) Protječite citometrijsku analizu postotka aktivnosti kaspaze-3 i PI-pozitivnih stanica u naznačenim vremenskim točkama nakon TNF stimulacije stanica L929pCasper3-BG (senzora apoptoze na bazi FRET) u kojima su RIP1, RIP1 + kaspaza-8, ili RIP1 + kaspaza-8 + RIP3 su srušeni. ( b ) protočna citometrijska analiza postotka aktivnosti kaspaze-3 i PI-pozitivnih stanica u naznačenim vremenskim točkama nakon TNF stimulacije ćelija L929pCasper3-BG u kojima su RIP1, RIP1 + TRADD i RIP1 + TRADD + RIP3 srušeni. Trake pogrešaka ukazuju na S.D-ove trostruke podatke, a podaci su reprezentativni za najmanje dva neovisna eksperimenta. Učinkovitost zaustavljanja navedenih proteina određena je zapadnim blotiranjem

Slika pune veličine

Rasprava

TNF-inducirana nekroptoza je regulirani oblik stanične smrti koji uključuje kinaznu aktivnost RIP1 i RIP3 u početnoj fazi. 20 Međutim, još se malo zna o regulatornim mehanizmima koji moduliraju osjetljivost na nekroptozu uzrokovanu TNF-om. U ovom istraživanju ispitali smo utjecaj represivnih proteina za koje se zna da su regrutovani za TNFR1-CI i / ili TNFR1-CII na odluku L929 stanica da umiru nekroptotski.

Unutar TNFR1-CI, cIAP1 / 2 konjugira RIP1 s nerazgradljivim ubikvitinim lancima, 5 i prijavljeno je da taj događaj sprječava da se RIP1 integrira u kompleks II. 5, 9 Naše prvobitno opažanje da cIAP1 štiti L929 stanice od nekroptoze izazvane TNF-om sugerira da ubikvitacija RIP1 također inhibira stvaranje nekrosoma. 26 Otkriće da je RIP1 ključni posrednik aktiviranja NF-B B izazvanog TNF-om u stanicama L929, tada je doveden u pitanje relativni doprinos NF- κ B aktivacije citoprotektivnom mehanizmu posredovanom ubikvitiniranim RIP1. Šutnja NEMO-a ili TRADD-a nije senzibilizirala nekroptozu uzrokovanu TNF-om, dok je oborenje LUBAC-ove komponente HOIP i u manjoj mjeri HOIL-1 pojačalo nekroptozu uzrokovanu TNF-om, premda su sve represije rezultirale približno sličnim smanjenjem degradacije I κ B α u odgovoru na TNF. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da NF-B B aktivacija nema veliku citoprotektivnu ulogu u ovom staničnom sustavu i otkrili su negativnu regulatornu funkciju LUBAC na nekroptozu uzrokovanu TNF-om. Zabilježeno je da se LUBAC regrutuje za TNFR1-CI za stabilizaciju kompleksa. 4 Stoga je moguće da potiskivanje LUBAC komponenata destabilizira TNFR1-CI i olakšava stvaranje nekrosoma.

Promatranje da destrukcija CYLD-a spašava L929 stanice od nekroptoze izazvane TNF-om 26, 27 sugerira da je za pokretanje nekroptoze potrebna deubikvitacija RIP1. Pored CYLD-a, 11 RIP1 je također deubikvitiniran od strane A20 u signalnom putu TNF-a. 32 Međutim, nasuprot suzbijanju nekroptoze knockdownom CYLD-a, prigušivanje A20 povećalo je osjetljivost na smrt nekroptotskih stanica uzrokovanih TNF-om. Prema tome, iako su i CYLD i A20 enzimi 63-deubikvitinirajući lizini RIP1, čini se da djeluju različito tijekom nekroptoze izazvane TNF-om. Preosjetljivost na nekroptozu iscrpljivanjem A20 slaže se s opažanjem da prekomjerna ekspresija A20 inhibira nekroptozu uzrokovanu TNF-om u stanicama L929, 39 kao i staničnu smrt makrofaga, izazvanu TNF-om. 40 Za razliku od CYLD-a, za A20 je objavljeno da ima i aktivnost e3 ubikvitin ligaze, pored svojih svojstava deubikvitinaze. 32 Stoga je moguće da ili aktivnost deubikvitinaze ili aktivnost E3 ubikvitin ligaze A20 inhibira ili aktivira potencijal smrti ili proživljavanja, komponenata TNFR1-CI, ali i TNFR1-CII. Također je važno napomenuti da citotoksična uloga CYLD-a u indukciji nekroptoze možda nije na razini RIP1 ili ne samo na razini RIP1. Zapravo, otkrili smo da represija CYLD-a također štiti L929 stanice od nekroze izazvane vodikovim peroksidom (dopunska slika 5), ​​koja se događa neovisno o RIP1 i RIP3. 12, 35

TNFR1-CII se formira nizvodno od TNFR1-CI. Ovaj citosolni kompleks koji izaziva smrt sastoji se od RIP1, RIP3, FADD, TRADD i kaspaze-8. Da li je TRADD strogo potreban u signalnoj nekroptozi uzrokovanoj TNF-om je kontroverzno. U Jurkat T stanicama, TRADD osiromašenje nije utjecalo na nekroptozu uzrokovanu TNF-om 38, dok su mišje embrionalne fibroblastne stanice (MEF) sa nedostatkom TRADD-a zaštićene od nekroptoze izazvane TNF-om u prisutnosti CHX i zVAD-fmk. 28 U skladu s podacima Jurkata, kojima ne treba CHX za indukciju nekroptoze, otkrili smo da osiromašenje TRADD-a u stanicama L929 nije utjecalo na nekroptozu uzrokovanu TNF-om. Međutim, u uvjetima rušenja RIP1, primijetili smo da je TRADD važan za apoptozu posredovanu TNF-om, sugerirajući da uloga TRADD u indukciji stanične smrti ovisi o staničnom stanju.

Nekoliko neovisnih izvještaja pokazalo je da iscrpljivanje RIP1 blokira nekroptozu izazvanu TNF-om u prisutnosti inhibitora kaspaze zVAD-fmk, 12, 35, ali to ne čini u nedostatku zVAD-fmk. 27 Otkrili smo da u L929 stanično obaranje RIP1, ali ne i RIP3, čak potencira TNF-induciranu staničnu smrt i prebacuje je iz nekroptoze u apoptozu (Slika 5), ​​što najvjerojatnije objašnjava zašto iscrpljivanje RIP1 u nedostatku zVAD-fmk-a ne blokirati staničnu smrt u L929 stanicama. 27 RIP1 knockout miševi umiru ubrzo nakon rođenja zbog masivne apoptoze, što je u početku objašnjeno nepostojanjem NF- κ B aktivacije i istodobnim smanjenim signalom preživljavanja. 41 Sada je dovedena u pitanje ekskluzivna veza između aktivacije RIP1 i NF- κ B jer je nekoliko tipova stanica iz zametaka sa nedostatkom RIP1 još uvijek aktiviralo NF- κ B nakon stimulacije TNF-om. 8 U L929 stanicama uočili smo prelazak na apoptozu čak i kada je pad RIP1 bio manje učinkovit i nije utjecao na aktivaciju NF- κ B (podaci nisu prikazani), što ukazuje da RIP1 može ispuniti anti-apoptotičku ulogu neovisno o NF- κ B- modulirajuća aktivnost. RIP1-posredovana supresija apoptoze nije posljedica fosforilacije pro-apoptotskih proteina FADD i kaspaze-8, jer inhibicija aktivnosti RIP1 kinaze Nec-1 nije inducirala apoptozu nakon stimulacije TNF-om. 26, 35 RIP1 i TRADD natječu se za vezanje za TNFR1. 2, 38 Stoga je zamislivo da gubitak RIP1 povećava regrutovanje TRADD-a za kojeg se navodi da pogoduje indukciji apoptoze. 38 Pokazalo se da je nedostatak RIP1 doveo do iscrpljivanja c-FLIP, 42 što je također stanje osjetljivosti na apoptozu. Uzeto zajedno, poboljšani TRADD regrutovanje i smanjena razina c-FLIP-a mogu objasniti pomak s nekroptoze na apoptozu kao odgovor na TNF.

Image

Sažetak RNAi studije nekroptoze izazvane TNF-om u stanicama L929. Kod TNFR1 kompleksa II apoptotski proteini FADD, kaspaza-8 i c-FLIP suzbijaju nekroptozu uzrokovanu TNF-om. RIP1 knockdown prelazi TNF-induciranu nekroptozu nezavisnu od TRADD u apoptozu ovisnu o TRADD. Kombinirani pad RIP1 i kaspaze-8 blokira apoptozu, ali ne utječe na stupanj stanične smrti. Ova smrt nekroptotskih stanica nezavisnih od RIP1 može se blokirati brisanjem i RIP3.

Slika pune veličine

Primijetili smo da kombinirani pad RIP1 i TRADD potpuno blokira TNF-induciranu apoptozu, ali dopušta, u određenoj mjeri, RIP3 ovisnu indukciju nekrotične stanične smrti u L929 stanicama. Istovremeni pad RIP1 i kaspaze-8 također spašava od apoptotske ćelijske smrti, ali još uvijek omogućuje potpunu indukciju stanične smrti, koja se može inhibirati prigušivanjem RIP3. Ovo ukazuje da, kad su i RIP1 i kaspaza-8 odsutni, TRADD vjerojatno regrutuje FADD / RIP3, jer ti proteini konstitutivno djeluju. 12 Iako se pokazalo da TNF-inducirano sastavljanje nekrosoma zahtijeva aktivnost RIP1 kinaze, 12, 34, naši rezultati pružaju model u kojem nastajanje nekrosoma i naknadna nekroptoza nastaju bez RIP1. To podrazumijeva da određeni stanični uvjeti mogu zaobići potrebu za RIP1 u sastavu nekrosoma i aktivaciju RIP3. Zapravo, slična nekroptoza ovisna o RIP1, ali RIP3, nakon ektopične ekspresije RIP3, opisana je u MEF stanicama 23 sa nedostatkom RIP1 i novije vrijeme, tijekom virusne infekcije. 24

Ovo istraživanje RNAi u stanicama L929 pokazuje kako propadanje nekoliko proteina signalizacije TNF-a uključenih u TNFR1-CI i II snažno modulira nekroptozu uzrokovanu TNF-om (Tablica 1). S obzirom na sličnost opažanja u stanicama L929 i ostalih staničnih sustava povezanih sa signalizacijom izazvanom TNF-om, 12, 15, 22, 23, 34 i njihove potvrde u kontekstu in vivo , 17, 18, 23, L929 stanice smatramo a dobar in vitro stanični sustav za proučavanje signala molekularne smrti kao odgovor na TNF. Ovi rezultati daju prednost u ispitivanju uloge ovih proteina u eksperimentalnim in vivo modelima bolesti u kojima se pretpostavlja da nekroptoza ima ulogu. Ovo je prvo izvješće (i) koje ilustrira citoprotektivnu ulogu A20 i LUBAC u nekroptozi uzrokovanoj TNF-om, (ii) objašnjavanje zašto iscrpljivanje RIP1 u nedostatku zVAD-fmk ne blokira staničnu smrt, uslijed prelaska na apoptozu i ( iii) prikaz induciranja nekroptoze ovisne o RIP3 u odsutnosti RIP1 u kontekstu signalizacije TNF-a. Konačno, naši bi rezultati mogli imati važne terapijske posljedice za strategije kojima je cilj senzibilizirati nekroptozu kako bi zaobišli otpornost tumorskih stanica na apoptozu ili izazvali imunogeniji oblik stanične smrti. Desenzibilizacijska nekroptoza može biti terapeutski korisna kod degenerativnih bolesti poput ishemijsko-reperfuzijskog oštećenja tijekom zatajenja srca, moždanog udara, dijabetesa tipa II i transplantacije organa. 20

Tablica pune veličine

Materijali i metode

materijali

Koristili smo TNF i Fas antitijelo da potaknemo staničnu smrt. Rekombinantni ljudski TNF proizveden je i pročišćen u našem laboratoriju do najmanje 99% homogenosti, a njegova specifična biološka aktivnost bila je 3 × 10 7 IU / mg. Koristili smo ljudski TNF jer je specifični agonist za mišji TNFR1 i ne djeluje na TNFR2. Klon protiv humanog Fas antitijela 2R2 bio je iz Cell Diagnostica, Munster, Njemačka. H202 30% i 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolijev bromid (MTT) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SAD) korišteni su u 2 mM i 500 μ g / ml, respektivno. Gubitak propusnosti membrana plazme praćen je upotrebom 5 nM Sytox crvene mrtve stanice (Molekularne sonde – Invitrogen, Eugene, OR, SAD) i 3 μM propidijum-jodida (PI, Sigma Aldrich). Nuklei su obojeni pomoću Hoechst 33242 (Molekularne sonde – Invitrogen). Sljedeća antitijela korištena su za Western blot analizu: anti-HOIL-1 antitijelo (dar H Walczaka); anti- β -bubulin (HRP) (Ab21058, Abcam, Cambridge, Velika Britanija); anti- p- aktin (klon C4, MP Biomedicals Europe NV, Illkirch, Francuska); anti-kaspaza-8 (1G12, Alexis, Enzo Life Sciences, Zandhoven, Belgija); anti-RIP1 (610459, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA); anti-RIP3 (R4277, Sigma Aldrich); zečje poliklonalno antitijelo protiv mišje kaspaze-3 (proizvedeno unutar kuće); cijepano antitijelo kaspaza-3 (9661; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD). Antitijela na A20 (A-12), FADD (M-19), I κ B α (C-21), NEMO (FL-419) i TRADD (H-278) kupljena su od Santa-Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija, SAD).

Stanične linije

L929sAhFas stanice nastale su ekspresijom ljudskog Fas gena u L929sA stanicama, TNF-osjetljivim derivatima mišje fibrosarkomne stanične linije L929. 16. Te se stanice nazivaju L929 stanice i uzgajaju se u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle-a uz dodatak 10% fetalnog seruma teleta, penicilina (100 IU / ml), streptomicina (0, 1 mg / ml) i L-glutamina (0, 03%), L929pCasper3-BG stanice napravljene su transfektiranjem vektora pCasper3-BG (FP970; Evrogen, Moskva, Rusija) u L929sAhFas stanice metodom kalcijevog fosfata. Nakon transfekcije, stanice su razvrstane četiri puta pomoću protočnog citometra Beckman Coulter Altra (Beckman Coulter, Brea, CA, SAD) radi dobivanja L929pCasper3-BG ćelija s jakom ekspresijom pCasper3-BG.

Analiza staničnog preživljavanja, stanične smrti i aktivnosti kaspaze-3

L929 ili L929pCasper3-BG stanice prethodno su obrađene sa Nec-1 tijekom 1 sata, a zatim stimulirane TNF (10 000 IU / ml) ili anti-Fas (125 ng / ml) za naznačena razdoblja. Smrt L929 stanica analizirana je protočnom citometrijom na dual-laserskom FACSCaliburu (488 nm, 635 nm) s Cellquest softverom (BD Biosciences). Istodobna analiza stanične smrti i aktivnosti kaspaze-3 u L929pCasper3-BG stanicama provedena je pomoću trostrukog lasera LSR-II (405, 488 i 635 nm) s FACSDiva softverom (BD Biosciences). Stanična smrt ili gubitak integriteta plazmatske membrane utvrđeni su mjerenjem Sytox Red (Molekularne sonde – Invitrogen, Eugene, OR, SAD) ili propidijum-jodid (PI) –ponirana fluorescencija. Aktivnost kaspaze-3 utvrđena je Casper3-BG, senzorom apoptoze temeljenim na FRET koji se sastoji od plavog fluorescentnog proteina TagBFP spojenog DEVD sekvencom sa zelenim fluorescentnim proteinom, TagGFP2. Tijekom apoptoze, cijepanje DEVD-a kaspazom-3 ​​uklanja FRET i povećava omjer TagBFP: TagGFP2. Za analizu aktivnosti kaspaze-3 osigurane su samo održive stanice (PI negativne). Svi su pokusi izvedeni najmanje dva puta u tri primjerka. Stanični opstanak određen je MTT testom. Nakon 20 sati TNF stimulacije, MTT je dodan u 500 µg / ml 4 h, nakon čega je slijedila liza u 10% SDS / 0, 1 M HCl. Apsorbancija je izmjerena pomoću standardnog čitača mikroploča s 595 nm filterom i referentnim filtrom 655 nm.

RNAi posredovani knockdown

L929 i L929pCasper3-BG stanice transficirane su u ploče sa šest jažica prema protokolu proizvođača koristeći 20 nM siRNA ciljajući A20, kaspazu-8, c-FLIP, HOIL-1, HOIP, NEMO, RIP1, RIP3 i TRADD (mješavina četiri siRNA, ON-TARGET plus SMART bazen siRNA, Dharmacon, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Kao negativnu kontrolu koristili smo siCONTROL ne-ciljanu siRNA (ON-TARGET plus SMART bazen siRNA, Dharmacon). INTERFERin (Polyplus-transfection SA, Illkirch, Francuska) korišten je kao transfekcijski reagens. Pripadanje FADD-a izvedeno je retrovirusnom infekcijom s pRetroSuper konstruktom (DNAengine Inc., Seattle, WA, SAD) koji sadrži sekvencu čuvnih lanaca 5'-CAGACTTTCAGACTCTCCCTT-3 '. Pomiješana pRetroSuper shRNA korištena je kao negativna kontrola. Prvo, shRNA su uvedeni u QNX-A stanice (Nolan Lab, Stanford, Kalifornija, SAD) transfekcijom kalcijevim fosfatom. Nakon 24 i 48 sati sakupljen je virusni supernatant stanica QNX-A, dodan je polibren (Sigma Aldrich) (16 μg / ml), a virusni supernatant korišten je za inficiranje L929 stanica centrifugiranjem pri 1500 o / min na 32 ° C 90 min. Nakon 72 ili 96 h oborenja siRNA ili shRNA, stanice su stimulirane TNF-om i određena je stanična smrt kao što je gore opisano. Učinkovitost zaustavljanja provjerila je Western blot ili RT-PCR.

RT-PCR

RNK je pripremljena iz L929 stanica pomoću RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka). Počevši od 2 μg RNA, cDNA se sintetizirala pomoću SuperScript reverzne transkriptaze III kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). PCR je proveden pomoću GoTaq Green Mastermix-a (Promega, Madison, WI, USA). PCR proizvodi su razdvojeni na 2% agaroznom gelu i vizualizirani SYBR Safe DNA gel bojom (Molecular Probes – Invitrogen). Korišteni su sljedeći prajmeri: c-FLIP L : Fwd 5 '-CCTCCAGCTCATCCTCTGTG-3' i Rev 5 '-TTTGTCCATGAGTTCAACGTG-3'; c-FLIP R : Fwd 5′- GCTGCTGTGGTTCTGAACATG-3 ′ i Rev 5′-GGTACTCCATACACTGGCTCC-3 ′; HOIP: Fwd 5 '- GCTTCATCTATGAACGCGAAC-3' i Rev 5'- ATTGGTGCGTTTCCAGTTCT-3 '.

Mikroskopija

Vremenska mikroskopija L929 stanica koje su uzgajane u komorama s osam jažica Lab-Tek (Nunc, VWR international, Heverlee, Belgija) provedena je korištenjem Leica AS MDW živih stanica za obradu stanica (Leica Microsystems, Mannheim, Njemačka). Ovaj sustav uključuje DM IRE2 mikroskop (Leica Microsystems, Mannheim, Njemačka) opremljen HCX PL APO 63 × /1, 3 glicerinom korigiranim 37 ° C ciljem i 12-bitnim Coolsnap HQCamerom. Mikroskop je okružen inkubacijskom komorom koja održava stanice na 37 ° C u okruženju sa 5% C02. Promatrana je stanična morfologija korištenjem diferencijalnog interferencijskog kontrasta (DIC). Stanice su praćene 8 h, a višestruki z-nizovi slika su hvatani svakih 5 min. Unutar z-staka postavljene su različite žarišta u intervalima od 1 µm kako bi se spriječio gubitak fokusa tijekom procesa stanične smrti. Hoechst 33342 bio je uzbuđen na 380 nm, a emisija je detektirana pomoću filtarne kocke BP340 / 80 / FT400 / LP425. PI je bio uzbuđen pri 540 nm, a emisija je detektirana pomoću filtra BP515-560 / FT580 / LP590. Iz svake su se skupine slika izrađivale projekcije maksimalnog intenziteta (za Hoechst i PI) i slike automatskog fokusiranja (za DIC) za svaku vremensku točku pomoću skripte razvijene u vlastitom softveru za obradu slika iz javne domene Fidžija (//fiji.sc/wiki/ index.php / Fiji).

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Glosar

c Flip

stanični FLICE inhibitorni protein

CHX

cikloheksimidna

cIAP1

stanični inhibitor proteina apoptoze

CYLD

cylindromatosis

FADD

Fas-povezani protein putem domene smrti

FRET

Förster rezonancijski prijenos energije

HOIP

HOIL-1-interaktivni protein

HOIL-1

heme-oksidirano željezo regulatorni protein 2 ubikvitin ligaza-1

IKK

inhibitor NF- κ B kinaze

I κ B

inhibitor NF- κB

LUBAC

kompleksni sklop linearnog ubikvitina lanca

MEF

mišji embrionalni fibroblast

Dn-1

necrostatin-1

NEMO

NF- κ B osnovni modulator

JU

propidijev jodid

POČIVAO U MIRU

protein koji djeluje na receptor

TAK1

transformirajući faktor rasta - β- aktivirana kinaza 1

TNF

faktor nekroze tumora

TNFR

receptor faktora nekroze tumora

TRADD

Područje smrti povezano sa TNF receptorima

TRAF2

Faktor 2 povezan sa TNF receptorima

zVAD-FMK

benziloksikarbonil-Val-Ala-Asp (OMe) -fluoromethylketone

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Cell and Disease (//www.nature.com/cddis)