Tretman antagonistom a2a receptora kw6002 i unosom kofeina reguliraju reaktivnost mikroglije i štite mrežnicu od prolaznih ishemijskih oštećenja | stanična smrt i bolest

Tretman antagonistom a2a receptora kw6002 i unosom kofeina reguliraju reaktivnost mikroglije i štite mrežnicu od prolaznih ishemijskih oštećenja | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • mikroglije
  • ishrana
  • Farmakologija
  • Bolesti mrežnice

Sažetak

Prolazna ishemija mrežnice glavni je komplikacija degenerativnih bolesti mrežnice i pridonosi oštećenju vida i sljepoći. Dokazi ukazuju da mikroinflamija posredovana ključnom ulogom u neurodegenerativnom procesu, što potiče hipotezu da kontrola reaktivnosti mikroglije može pružiti neuroprotekciju mrežnici protiv oštećenja izazvanog ishemijom-reperfuzijom (I-R). Dostupne terapijske strategije za degenerativne bolesti mrežnice imaju ograničen potencijal, ali blokada adenosin A2A receptora ( A2A R) pojavljuje se kao strategija kandidata. Stoga smo procijenili terapeutski potencijal selektivnog A2A R antagonista (KW6002) naspram oštećenja nastalih I-R. Primjena KW6002 nakon ozljede I-R smanjila je reaktivnost mikroglije i upalni odgovor i pružila zaštitu mrežnici. Štoviše, testirali smo sposobnost kofeina, antagonista receptora adenozina, u posredovanju zaštite mrežnice u I-R modelu ozljede. Pokazali smo da kofein daje dvostruko reguliranu reaktivnost mikroglije i staničnu smrt u modelu prolazne ishemije mrežnice, ovisno o vremenu reperfuzije. Nakon 24 sata reperfuzije, kofein je povećao mikroglijsku reaktivnost, upalni odgovor i staničnu smrt izazvanu I-R. Međutim, nakon 7 dana reperfuzije, primjena kofeina smanjila je reaktivnost mikroglije i smanjila razinu proupalnih citokina i stanične smrti. Zajedno, ovi rezultati daju novi dokaz za upotrebu antagonista adenosina A2A R kao potencijalne terapije ishemijskih bolesti mrežnice i pokazuju učinak kofeina na regulaciju neuroinflamation posredovane mikroglijom u prolaznom ishemijskom modelu.

Glavni

Privremena ishemija mrežnice odnosi se na patološko stanje koje uključuje gubitak opskrbe krvlju tkivom, što rezultira iscrpljivanjem energije, disfunkcijom, oštećenjem i smrću neuronskih stanica. 1 Ova značajka određuje patofiziologiju nekoliko retinalnih bolesti poput akutnog glaukoma zatvorenog kuta i dijabetičke retinopatije, doprinoseći oštećenju vida i sljepoći. Trenutno ne postoji lijek za ove retinalne bolesti, a raspoloživi tretmani nisu baš učinkoviti, posebno su zanimljivi za prepoznavanje novih terapijskih strategija za upravljanje tim poremećajima.

Model akutnog povišenja intraokularnog tlaka (IOP) praćen reperfuzijom (ishemija-reperfuzija, I-R) korišten je za proučavanje molekularnih mehanizama koji stoje na osnovi ishemije mrežnice i za razvoj novih potencijalnih terapijskih strategija. 2 Mikroglialne stanice, imunokompetentne stanice središnjeg živčanog sustava (CNS) i prve osobe koje reagiraju na oštećenje neurona, 3, 4 postaju reaktivne na retinalni I-R, 5 kao što se javlja i kod degenerativnih bolesti mrežnice. 8 Trajna aktivacija mikroglije dovodi do prekomjerne proizvodnje upalnih medijatora koji pridonose neurodegeneraciji mrežnice. 8, 9 To upućuje na mogućnost da sustavi koji mogu kontrolirati reaktivnost mikroglije mogu biti prikladni za upravljanje neurodegenerativnim procesom.

Jedna kandidat-strategija upravlja adenosinergičkim sustavom, naime sposobnost blokade adenosina A2A receptora ( A2AR ) u kontroli reaktivnosti mikroglije, čime se pruža neuroprotekcija. 10, 11, 12 Nedavno smo pokazali da selektivni A2AR antagonist (SCH58261) sprječava reaktivnost mikroglija mrežnice i neuroinflamation izazvane povišenim tlakom u in vitro modelu. 13 Nadalje, intratralno davanje SCH58261 prije I-R ozljede sprječava mikroglija posredovanu neuroinflamation i pruža zaštitu mrežnici. 5 Međutim, još uvijek nije poznato učinke antagonista A2A R primijenjenog nakon I-R.

Kofein je psihoaktivna droga koja se najčešće konzumira i u netoksičnim dozama cilja adenozinske receptore, uglavnom inhibitorni adenosin A1 receptor (A 1R) i olakšavajući A2A R. 14 Dokazano je da kofein pruža snažnu neuroprotekciju u različitim neurotoksičnim situacijama u mozak, učinak koji je posredovan blokadom A 2A R. 15, 16, 17, 18, 19 Štoviše, otkrili smo da kofein ublažava gubitak staničnih ganglionskih stanica (RGC) kod životinja s očnom hipertenzijom. 20 Ipak, još uvijek nije poznato da li kofein štiti od ozljede mrežnice I-R, jer je to patofiziološki proces koji pridonosi staničnoj oštećenju u više okularnih stanja.

Ciljevi ovog rada bili su istražiti terapeutski potencijal oralne primjene antagonista A2A R i učinke unosa kofeina protiv neuroinflamacije i stanične smrti izazvane I-R ozljedom.

Rezultati

Blokada A2A R spriječila je protuupalni odgovor na mrežnici potaknut prolaznom ishemijom

Nedavno smo pokazali da antagonist 2A R sprečava smrt RGC kontrolom neuroinflamation posredovanom mikroglijom. 5, 13 Stoga smo procijenili jesu li životinje s 2 A R-knockoutom (KO) manje podložne neuroinflamation potaknut ishemijskim oštećenjem mrežnice. Razine proinflamatornih faktora nekroze tumora (TNF) i interleukin-1 β (IL-1 β ) kvantificirane su u mrežnicama A 2A R-KO i WT životinja (slika 1a). Opisana je indukcija očne hipertenzije jednostrano kako bi aktivirala mikrogliju u kontralateralnom oku. 21 Imajući to u vidu, rezultati dobiveni u I-R mrežnicama normalizirani su na kontralateralno oko. Retinalni I-R nisu značajno promijenili razinu IL-1 β u obje skupine životinja (A 2A R-KO i WT). Međutim, razine TNF-a značajno su smanjene u I-R-podvrgnutim A 2A R-KO mrežnicama (I-R / kontralateralni omjer 0, 9 ± 0, 08, n = 6, P <0, 01) u usporedbi s WT životinjama (I-R / kontralateralni omjer od 1, 6 ± 0, 3, n = 6, P <0, 05).

Image

( a ) Učinci genetske blokade A 2A R u razinama IL-1 β i TNF-a u mrežnici podvrgnutoj prolaznoj ishemiji. 2A R-KO miševi podvrgnuti su ishemijskoj ozljedi. Razine proteina IL-1 p i TNF kvantificirale su ELISA 7 dana reperfuzije. Rezultati su izraženi kao omjer ishemijskog oka u usporedbi s kontralateralnim okom. * P <0, 05, značajno različit od kontralateralnog oka, Wilcoxon-ov test s potpisom; ## P <0, 01 značajno razlikuje od životinja tretiranih vozilima, Studentov t- test. ( b ) Učinci liječenja KW6002 na razine proteina IL-1 β i TNF na prolaznu ishemiju. KW6002 (3 mg / kg) primijenjen je oralnim putem 2 sata nakon ozljede i do kraja eksperimenta (7 dana reperfuzije). Razine IL- 1p i TNF kvantificirane su ELISA. Rezultati su izraženi kao omjer ishemijskog oka u usporedbi s kontralateralnim okom. * P <0, 05, značajno različit od kontralateralnog oka, Wilcoxonov test za rangiranje; # P <0, 05 značajno razlikuje od životinja tretiranih vozilima, Studentov t- test

Slika pune veličine

Uzimajući u obzir ove i druge rezultate 5, 13, dodatno smo proširili studiju kako bismo procijenili terapeutski potencijal A2A R antagonista protiv ozljede mrežnice I-R. Ovdje je tretiranje selektivnim A2A R antagonistom (KW6002, istradefylline) započeto nakon I – R ozljede i davano je svakodnevno u trajanju od 7 dana, za razliku od našeg prethodnog rada u kojem je prethodna pojedinačna intravitrealna injekcija 2AR antagonista I-R. Razina proteina IL-1 β i TNF kvantificirana je u mrežnici pomoću ELISA (slika 1b). U I-R mrežama životinjama liječenih vozilima razina proteina IL-1 β i TNF bila je 1, 8 ± 0, 2- ( n = 8, P <0, 05) i 1, 9 ± 0, 3 puta ( n = 8, P <0, 05) iznad kontralateralne mrežnice. U štakora tretiranih KW6002, razina proteina IL-1 β u I-R mrežama nije se značajno razlikovala od kontralateralnih retina (1, 2 ± 0, 2 puta veća, n = 8) i značajno je smanjena u usporedbi sa životinjama koje su tretirane nosačem ( P <0, 05 ). Razine TNF-a porasle su za 1, 8 ± 0, 2 puta u I – R mrežnici u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama ( n = 9, P <0, 05) kod životinja liječenih KW6002.

Tretman KW6002 smanjio je reaktivnost mikroglije nakon I – R ozljede

Učinak KW6002 na reaktivnost mikroglije izazvane mrežnicom I-R procijenjen je brojenjem broja stanica imunoreaktivnih na glavni kompleks histokompatibilnosti klase II (MHC-II; izražen u reaktivnoj mikrogliji) i ionizirani adapter za vezanje kalcija 1 (Iba1; konstitutivno izraženo u mikroglijama (Slika 2. i Dopunska slika S1). Reaktivnost mikroglije (MHCII + Iba1 + / Iba1 + stanice) značajno je povećana u I-R mrežnicama (28, 9 ± 5, 8% ukupnih stanica Iba1 +, n = 8, P <0, 001) u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama životinja koje su tretirane vozilom ( 0, 4 ± 0, 2% ukupnih Iba1 + stanica, n = 7). KW6002 tretman oslabio je reaktivnost mikroglije (17, 1 ± 3, 3% ukupne Iba1 + stanice, n = 8, P <0, 01) izazvane I-R, dok nisu opažene značajne promjene u kontralateralnim mrežnicama (2, 3 ± 1, 0% ukupnih Iba1 + stanica, n = 8) u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama životinja liječenih vozilima. Dodatno, KW6002 tretman (49, 5 ± 3, 5 Iba1 + stanice, n = 2) smanjio je povećani broj Iba1 + stanica induciranih mrežnicom I-R mrežnice (119, 0 ± 18, 2 Iba1 + stanice, n = 3) (Dodatna slika S1).

Image

Učinci liječenja s KW6002 u reaktivnosti mikroglije izazvane prolaznom ishemijom. KW6002 (3 mg / kg) primijenjen je oralnim putem 2 sata nakon ozljede i do kraja eksperimenta (7 dana reperfuzije). ( a ) Reaktivnost mikroglije procijenjena je u presjecima mrežnice označavanjem glavnih MHC-II (reaktivna mikroglija, crvena) i Iba1 (opći marker, zelena) na 7 dana ( a ) reperfuzije. Nuklei su obojeni DAPI (plavi). Prikazane su reprezentativne slike. ( b ) Broj aktiviranih mikroglija / makrofaga (MHC-II + Iba1 + stanice) izražen je kao postotak ukupnog broja mikroglija / makrofaga (Iba1 + stanice) u dijelu mrežnice u 7 dana reperfuzije. ** P <0, 01, *** P <0, 001, značajno različit od kontralateralnog oka, Mann-Whitneyjev test. ONL, vanjski nuklearni sloj; OPL, vanjski pleksiformni sloj; INL, unutarnji nuklearni sloj; IPL, unutarnji pleksiformni sloj; GCL, sloj ćelija gangliona

Slika pune veličine

KW6002 smanjuje staničnu smrt uzrokovanu prolaznom ishemijom mrežnice

Kako prolazna ishemija mrežnice izaziva smrt neuronskih stanica, 22 i neuroinflamation mogu doprinijeti neurodegeneraciji, 5 procijenili smo zaštitni učinak liječenja KW6002 brojeći staničnu smrt sa testom terminalnog deoksinukleotidil transferaza-posredovanog dUTP nick-end označavanja (TUNEL) (slika 3), U životinjama liječenim vozilima I-R je značajno povećao broj apoptotskih stanica mrežnice (15, 0 ± 5, 4 TUNEL + stanice po mm, n = 7, P <0, 01) u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama (0, 4 ± 0, 2 TUNEL + stanice po mm, n = 6). Liječenje KW6002 značajno je smanjilo smrt stanica izazvanih I-R (3, 0 ± 0, 7 TUNEL + stanica po mm, n = 6, P <0, 05) u usporedbi s I-R mrežnicama tretiranim nosačem. Broj apoptotskih stanica u kontralateralnim mrežnicama životinja liječenih KW6002 (0, 3 ± 0, 1 TUNEL + stanice po mm, n = 6) nije se značajno razlikovao od životinja tretiranih vozilima. Ovi rezultati pokazuju da blokada 2A R ima terapeutski potencijal protiv oštećenja uzrokovanih prolaznom ishemijom mrežnice.

Image

Učinci liječenja KW6002 na smrt stanica mrežnice nakon I – R ozljede. KW6002 (3 mg / kg) primijenjen je oralnim putem 2 sata nakon ozljede i do kraja eksperimenta (7 dana reperfuzije). ( a ) Stanična smrt je određena pomoću kriosekcije mrežnice TUNEL testom nakon 7 dana reperfuzije. Nuklei su obojeni DAPI (plava) i prikazane su reprezentativne slike. ( b ) TUNEL + stanice (sive, neke TUNEL + stanice označene su strelicama) se broje i izražavaju na mm mrežnice. ** P <0, 01, značajno različit od kontralateralnog oka; # P <0, 05, znatno se razlikuje od I – R mrežnice kod životinja koje su tretirane KW6002, Mann – Whitney test. ONL, vanjski nuklearni sloj; OPL, vanjski pleksiformni sloj; INL, unutarnji nuklearni sloj; IPL, unutarnji pleksiformni sloj; GCL, sloj ćelija gangliona

Slika pune veličine

Kofein modulira ekspresiju i razine proupalnih citokina

Kofein (1 g / l) primijenjen je u vodi za piće 2 tjedna prije I-R i do kraja eksperimenta (24 sata ili 7 dana reperfuzije). Unos tekućine nije se statistički razlikovao između dvije skupine životinja (tablica 1), kao što je ranije izvješteno. 23 Potrošnja kofeina i koncentracija kofeina u uzorcima seruma i mrežnice (dobiveni neposredno nakon ubijanja životinja) prikazani su u Tablici 1. Neki izvještaji pokazuju da kofein može utjecati na IOP, 24 učinak koji nije primijećen u ovoj studiji (Tablica 1).

Tablica pune veličine

Uzimajući u obzir zaštitna svojstva blokade A 2A R protiv ozljede mrežnice, a kako je kofein antagonist receptora adenozina koji je pokazao da pruža zaštitu u štetnim stanjima CNS-a, uključujući mrežnicu, 20 procijenili smo učinke unosa kofeina u I-R ozljeda. Unatoč tome što je zaštitni potencijal KW6002 procijenjen u 7 dana reperfuzije, naš prethodni rad pokazao je preventivni učinak A2A R antagonista na 24 sata reperfuzije. 5 Stoga smo proučavali učinke unosa kofeina na oštećenja I-R tijekom 24 sata i 7 dana reperfuzije.

Zatim je učinak davanja kofeina na ekspresiju mRNA i razine proteina IL- 1P i TNF procijenjen kvantitativnim PCR (qPCR) i ELISA, (Slika 4).

Image

Učinci davanja kofeina na ekspresiju i oslobađanje IL-1 β i TNF-a izazvanih prolaznom ishemijom. Kofein (1 g / l) primijenjen je u vodi za piće 2 tjedna prije ozljede i do kraja eksperimenta (24 sata i 7 dana reperfuzije). ( a i b ) Ekspresija IL-1 β i TNF mRNK procijenjena je qPCR-om nakon 24 h ( a ) i 7 dana ( b ) reperfuzije. Rezultati su predstavljeni kao kratka promjena ishemijskog oka u kontralateralne oči. ** P <0, 01, značajno različit od kontralateralnog oka, Wilcoxonov test s potpisom ranga; # P <0, 05 značajno se razlikuje od I – R retina životinja koje piju vodu, Mann – Whitney test. ( c i d ) Razine proteina IL- 1P i TNF kvantificirali su ELISA 24 sata ( c ) i 7 dana ( d ) reperfuzije. Rezultati su izraženi kao omjer ishemijskog oka i kontralateralnog oka. * P <0, 05, značajno različit od kontralateralnog oka, Wilcoxonov test za rangiranje; # P <0, 05, ## P <0, 01, značajno različita od I – R mrežnica životinja koje piju vodu, Mann – Whitneyjev test

Slika pune veličine

I nakon 24 sata i 7 dana reperfuzije, razine transkripta IL-1 β i TNF nisu se statistički razlikovale u I – R mrežnici u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama kod životinja koje piju vodu ( P > 0, 05) (Slike 4a i b). Međutim, nakon 24 sata reperfuzije, I-R skupina koja je pila kofein pokazala je značajno povećanu razinu transkripta IL-1 β i TNF-a, u usporedbi s oštećenim mrežnicama I-R koje su pile vodu (6, 3 ± 1, 5- i 6, 7 ± 1, 2 puta iznad) kontralateralno, n = 5 i n = 5, za IL- 1P i TNF, P, <0, 05). Analiza mRNA ekspresije IL-1 β i TNF životinja koje piju kofein u 7 dana reperfuzije pokazala je porast IL-1 β (1, 7 ± 0, 2 puta iznad kontralateralne, n = 10, P <0, 01), bez značajnog promjene u izrazu TNF.

Što se tiče razine IL-1 β i TNF proteina (slike 4c i d), nakon 24 h reperfuzije, I-R mrežnice životinja koje piju vodu otkrile su 2, 3 ​​± 0, 3 puta više od kontralateralnih mrežnica razine IL-1 β. ( n = 5, P = 0, 06), dok je zabilježen samo umjeren porast u razinama TNF-a (omjer I-R / kontralateralni oblik 1, 4 ± 0, 2, n = 5, P = 0, 06). Primjena kofeina nije značajno promijenila razinu IL-1 β i TNF u usporedbi sa životinjama koje piju vodu ( n = 6 i n = 7, P = 0, 06 i P = 0, 22 za IL-1 β i TNF, respektivno). U 7 dana reperfuzije, razina proteina IL-1 β i TNF u I-R mrežnicama koje su pile vodu bile su još uvijek veće od kontralateralnih retina (omjer I-R / kontralateralna vrijednost od 1, 7 ± 0, 2 i 1, 9 ± 0, 3 za IL-1 β i TNF, n = 6 i n = 9, P <0, 05). Primjereno, primjena kofeina smanjila je ovaj učinak (omjer I-R / kontralateralno 1, 0 ± 0, 1, n = 13, P <0, 05 i 1, 0 ± 0, 1, n = 12, P <0, 01 za IL-1 β i TNF, respektivno).

Kofein ima dvostruku regulaciju reaktivnosti mikroglije koja je inducirana prolaznom ishemijom

Učinak kofeina na reaktivnost mikroglije izazvane ishemijom nakon čega slijedi 24 h ili 7 dana reperfuzije analiziran je imunohistokemijskim bojenjem dijelova mrežnice (Iba1 i MHC-II, kako je opisano) i ekspresijom mRNA qPCR-om (Slika 5 i Dodatne slike S2 i S3). Kao što se i očekivalo, prolazna ishemija mrežnice potaknula je porast reaktivnosti mikroglije (Slike 5a-d i Dodatne slike S2 ​​i S3), što je također uočeno prijelazom iz razmnožene u amoeboidnu morfologiju (slika 5, unosi a-d). 24 sata nakon reperfuzije (slika 5c i dodatna slika S2), reaktivnost mikroglije lagano je povećana u I-R mrežnicama (12, 3 ± 5, 7% ukupnih stanica Iba1 +, n = 5) u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama (2, 5 ± 1, 6% od ukupan broj Iba1 + stanica, n = 5). Kod štakora koji su pili kofein, reaktivnost mikroglije bila je značajno povećana u I-R mrežnicama (18, 2 ± 6, 2% ukupnih stanica Iba1 +, n = 8, P <0, 01) u usporedbi s kontralateralnom mrežnicom (0, 6 ± 0, 6% ukupnih Iba1 + stanica, n = 8). Nadalje, nakon 24 h reperfuzije, primjena kofeina povećala je broj Iba1 + stanica (48.0 ± 7.0 Iba1 + stanice, n = 2) u usporedbi s I-R životinjama koje piju vodu (68.0 ± 5.5 Iba1 + stanica, n = 3) (Dopunska slika S2).

Image

Učinak davanja kofeina na reaktivnost mikroglije izazvane I-R ozljedom. Kofein (1 g / l) primijenjen je u vodi za piće 2 tjedna prije ishemijske ozljede i do kraja eksperimenta (24 sata i 7 dana reperfuzije). ( A i B ) Reaktivnost mikroglije procijenjena je u presjecima mrežnice označavanjem glavnih MHC-II (reaktivna mikroglija, crvena) i Iba1 (opći marker, zelena) 24 sata (a) i 7 dana (b) reperfuzije. Nuklei su obojeni DAPI (plavi). Prikazane su reprezentativne slike. Zabilježite u ulošcima (a –d) promjenu morfologije mikroglije iz razgranate u ameboidnu morfologiju, što ukazuje na reaktivnost mikroglije. ( C i D ) Broj reaktivnih mikroglija / makrofaga (MHC-II + Iba1 + stanice) izražen je kao postotak ukupnog broja mikroglija / makrofaga (Iba1 + stanice) u dijelu mrežnice u roku od 24 h (c) i 7 dana (d) reperfuzije. ** P <0, 01, *** P <0, 001, značajno različit od kontralateralnog oka; # P <0, 05, znatno se razlikuje od I – R mrežnica životinja koje piju vodu, Mann – Whitney test. ( E i F ) Ekspresija mRNA markera aktivacije mikroglije, TSPO i MHC-II, procijenjena je qPCR-om nakon 24 h (e) i 7 dana (f) reperfuzije. Rezultati su predstavljeni kao promjena na kontralateralnom oku. * P <0, 05, ** P <0, 01, značajno različit od kontralateralnog oka, Wilcoxonov test s potpisom; # P <0, 05, znatno se razlikuje od skupine pijenja vode, Mann-Whitney test. ONL, vanjski nuklearni sloj; OPL, vanjski pleksiformni sloj; INL, unutarnji nuklearni sloj; IPL, unutarnji pleksiformni sloj; GCL, sloj ćelija gangliona

Slika pune veličine

U 7 dana reperfuzije (slika 5d i dodatna slika S3), reaktivnost mikroglija značajno je porasla u I-R mrežnicama životinja koje piju vodu (19, 2 ± 4, 3% ukupnih Iba1 + stanica, n = 6, P <0, 01) u usporedbi s kontralateralna mrežnica (0, 5 ± 0, 3% ukupnih Iba1 + stanica, n = 6). Kofein je značajno oslabio reaktivnost mikroglije izazvanu prolaznom ishemijom (9, 6 ± 2, 0% ukupne Iba1 + stanice, n = 11, P <0, 05) u usporedbi s I – R mrežnicama od životinja koje piju vodu (1, 0 ± 0, 5% ukupnih Iba1 + stanica, n = 11). Pored toga, nakon 7 dana reperfuzije, primjena kofeina smanjila je broj Iba1 + stanica induciranih od I-R (132, 7 ± 35, 9 Iba1 + stanica, n = 3) u usporedbi sa skupinom koja pije vodu (89, 3 ± 3, 8 Iba1 + stanica, n = 3) (Dopunska slika S3).

Povećanje mRNA koja kodira protein translokatora (18 kDa) (TSPO) i za MHC-II obitelj (Cd74) koristi se kao marker reaktivnosti mikroglije. 5, 25 Stoga smo istražili je li kofein promijenio razinu mRNA proinflamatornih markera povezanih s mikroglijom MHC-II i TSPO izazvanih prolaznom ishemijom mrežnice (slike 5e i f). Kod životinja koje piju vodu dva su markera regulirana u mrežnici nakon I-R, dostižući statistički značaj u 7 dana reperfuzije (3, 6 ± 0, 5- i 19, 2 ± 6, 1 puta iznad kontralateralnog oka, n = 6 i n = 7, za TSPO i MHC-II, P, <0, 05). Unos kofeina različito je regulirao ekspresiju markera reaktivne mikroglije ovisno o vremenu reperfuzije. Primjena kofeina povećala je razinu ekspresije TSPO i MHC-II nakon 24 sata reperfuzije. Međutim, u 7 dana reperfuzije, razina ekspresije TSPO i MHC-II u mrežnici kod životinja koje piju kofein značajno se smanjila, u usporedbi s životinjama koje piju vodu (2, 2 ± 0, 3- i 9, 7 ± 2, 7 puta iznad kontralateralne, n = 10 i n = 10, za TSPO i MHC-II, P <0, 05).

Kofein regulira staničnu smrt izazvanu prolaznom ishemijom mrežnice

Konačno smo procijenili učinke kofeina na smrt apoptotske stanice u 24 sata i 7 dana reperfuzije (Slika 6).

Image

Učinci davanja kofeina na staničnu smrt uzrokovanu prolaznom ishemijom mrežnice. Kofein (1 g / l) primijenjen je u vodi za piće 2 tjedna prije ozljede i do kraja eksperimenta (24 sata i 7 dana reperfuzije). ( a i b ) Stanična smrt je određena u kriosekcijama mrežnice pomoću TUNEL testa 24 sata ( a ) i 7 dana ( b ) reperfuzije. Nuklei su obojeni DAPI (plavi). Prikazane su reprezentativne slike. ( c i d ) TUNEL + stanice (sive, neke TUNEL + stanice označene su strelicama) brojene su i izražene su na mm mrežnice. ** P <0, 01 i *** P <0, 001, značajno različiti od kontralateralnog oka; # P <0, 05, znatno se razlikuje od I – R mrežnica životinja koje piju vodu, Mann – Whitney test. ONL, vanjski nuklearni sloj; OPL, vanjski pleksiformni sloj; INL, unutarnji nuklearni sloj; IPL, unutarnji pleksiformni sloj; GCL, sloj ćelija gangliona

Slika pune veličine

Stanična smrt rani je događaj u modelu prolazne ishemije mrežnice, što je uočeno prisutnošću TUNEL + stanica već nakon 24 h reperfuzije (15, 4 ± 6, 8 TUNEL + stanica po mm, n = 4), znatno veće od kontralateralnih mrežnica ( 1, 2 ± 0, 6 TUNEL + stanica po mm, n = 5) životinja koje piju vodu (Slika 6c). Primjena kofeina povećala je broj apoptotskih stanica nakon 24 sata (44, 5 ± 5, 5 TUNEL + stanica po mm, n = 4, P <0, 01) u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama (0, 6 ± 0, 3 TUNEL + stanice po mm, n = 6). Ono što je važno, nije bilo značajnih razlika ( P > 0, 05) u broju TUNEL + u kontralateralnim mrežnicama (slika 6c), a primjena kofeina naivnim životinjama (ne-ishemične životinje koje su pile kofein u trajanju od 2 tjedna) nije uzrokovalo značajne promjene u broj apoptotskih stanica (0, 6 ± 0, 4 TUNEL + stanice po mm, n = 4, podaci nisu prikazani).

U 7 dana reperfuzije (slika 6d) povećao se broj apoptotskih stanica u I-R mrežnicama životinja koje piju vodu (6, 6 ± 1, 3 TUNEL + stanice po mm, n = 5, P <0, 01) u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama ( 0, 5 ± 0, 1 TUNEL + stanice po mm, n = 5). Također, kofein je značajno smanjio broj apoptotskih stanica u I – R mrežnici (3, 7 ± 0, 9 TUNEL + stanica po mm, n = 10, P <0, 05) u usporedbi s kontralateralnim mrežnicama (0, 3 ± 0, 1 TUNEL + stanice po mm, n = 10 ). Primjena kofeina tijekom 3 tjedna nije promijenila broj TUNEL + stanica u neishemijskim mrežnicama (0, 17 ± 0, 02 TUNEL + stanice po mm, n = 2, podaci nisu prikazani).

Rasprava

Ovo istraživanje pokazuje da oralno liječenje KW6002, selektivnim A2A R antagonistom, započetim nakon ishemije, učinkovito smanjuje neuroinflamation i pruža zaštitu mrežnici. Štoviše, pokazujemo da primjena kofeina dvostruko regulira reaktivnost mikroglije i staničnu smrt u modelu prolazne ishemijske mrežnice, ovisno o vremenu reperfuzije: u početku pogoršava reaktivnost mikroglije i povećava smrt neurona, dok pruža trajnu i vremenski odgođenu zaštitu mikroglija reaktivnosti i neuroprotekcija u mrežnici.

Prolazna ishemija izazvana visokim IOP predstavlja koristan model za proučavanje histopatoloških promjena na mrežnici. Model ozljede mrežnice I-R rekapitulira nekoliko značajki ishemijskih bolesti mrežnice, uključujući smrt neurona, upalu i reaktivnost mikroglija. 5, 7, 26 Ishemijsko razdoblje izravno pokreće gubitak staničnih funkcija mrežnice27, dok reperfuzija tkiva mrežnice izaziva dodatne ozljede, vjerojatno zbog oksidativnog stresa i stvaranja slobodnih radikala. 1 Dakle, reakcija mrežnice na I-R uključuje dvostruki postupak oštećenja, koji je ovisan i o trajanju i veličini ishemije, kao i o vremenu reperfuzije. 28

Blokada A2A R izravno kontrolira neuroinflamation 12 i pruža čvrstu zaštitu kod različitih neurodegenerativnih bolesti povezanih s kroničnim neuroinflamation. 29, 30 Mi i drugi smo pokazali da blokada 2A R sprječava smrt ćelija mrežnice i neuroinflamation posredovanu mikroglijom u različitim in vitro i životinjskim modelima degenerativnih bolesti mrežnice, uključujući model retinalnog I-R ozljeda štakora. 5, 13, 31, 32 Nedavno smo izvijestili da jedna intravitrealna injekcija SCH58261, selektivnog A2A R antagonista, prije indukcije retinalne ishemije, sprečava reaktivnost mikroglije i gubitak stanica izazvane I-R (24 sata reperfuzije), 5

U retinalnom I-R modelu čini se da su IL-1 β i TNF glavni učinci oštećenja mrežnice. 33, 34 Kako brisanje A2A R ne inducira promjene nivoa TNF-a u mrežnici, 35 smanjena razina TNF-a u miševima A2A R-KO nakon prolazne ishemije mrežnice unapređuje izglede da je iscrpljivanje A2A R sposobno smanjiti upalu nakon ozljede mrežnice.

Unatoč činjenici da genetska delecija ili farmakološka blokada A2A R pružaju zaštitu mrežnici, terapeutski učinak antagonista A2A R nije bio poznat. Stoga smo dodatno proširili studiju procjene terapijskog potencijala A2A R antagonista protiv ozljede mrežnice I-R. KW6002 (istradefylline) smatra se najprikladnijim A2A R antagonistom za oralnu primjenu u studijama CNS-a na temelju njegove bioraspoloživosti, poluživota i penetracije u mozak. 36 Uz to, KW6002 je prošla kliničko ispitivanje Parkinsonove bolesti jer je utvrđena njegova sigurnost, a 37 je odobreno za adekvatno liječenje Parkinsonove bolesti u Japanu. 38

Primjena KW6002 nakon izazivanja ishemije štitila je mrežnicu od prolaznih ishemijskih oštećenja. Iako su i IL-1 β i TNF povišeni u ishemijskim mrežnicama i poznato je da posreduju od I-R oštećenja, 34 KW6002 samo je smanjila razinu IL-1 β , sugerirajući da bi mogao biti dovoljan da inducira gubitak stanica. U prethodnom radu izvijestili smo da intravitrealna primjena SCH58261 sprečava povećanje IL-1 β bez utjecaja na TNF. 5. Pretpostavlja se da bi neurozaštita koju pruža blokada 2A R mogla biti rezultat sposobnosti A2AR da kontrolira pogoršanje ekscitotoksičnog oštećenja neurona IL- 1P- inducirano. 39, 40 Iako ne možemo identificirati stanične tipove koji sudjeluju u proupalnom odgovoru, mikroglijske ćelije glavni su nositelji povećanja upalnog odgovora. 8 Uz to, naši prethodni radovi podržavaju tvrdnju da prethodna obrada s 2A R antagonistom u mikroglici sprječava neuroinflamation posredovanu mikroglijom i pruža zaštitu mrežnici. 5, 13 Prema tome, sada smo primijetili da KW6002 također smanjuje reaktivnost mikroglije, vjerojatno izravnim djelovanjem na mikrogliju jer su ove stanice obdarene A2A Rs i njihova ekspresija se povećava u štetnim uvjetima. 5, 13, 31 Prethodni radovi demonstrirali su zaštitna svojstva A2AR antagonista koji se primjenjuju intravitrealnom injekcijom 5, 31 i intraperitonealnom injekcijom. 16 Koliko znamo, ovo je prvo izvješće koje pokazuje da oralna primjena selektivnog A2AR antagonista ima terapijska svojstva protiv oštećenja mrežnice. Ovo može biti od posebne važnosti u kliničkom okruženju jer će za liječenje kroničnih neurodegenerativnih bolesti mrežnice biti potrebno višestruko intravitrealno ubrizgavanje, što predstavlja dodatne komplikacije kao infekcije ili odvajanje mrežnice. 41

Učinci kofeina djeluju blokadom adenosinskih receptora, uglavnom A2A R i A 1 R. 14 U stvari, čini se da je 2A R glavna meta kofeina, kada posreduje neuroprotekciju. 15, 16, 17, 18, 19 Ranije smo otkrili da kofein smanjuje gubitak RGC kod životinja s očnom hipertenzijom. Iako su zaštitni rezultati s KW6002 procijenjeni tek u 7 dana reperfuzije, naš prethodni rad pokazao je preventivne učinke antagonista A2A R na 24 sata reperfuzije. 5 Stoga smo dizajnirali našu studiju za procjenu učinaka unosa kofeina na ozljedu mrežnice I – R i nakon 24 sata i 7 dana reperfuzije. Otkrili smo da učinci kofeina ovise o vremenu analizirane reperfuzije.

Nakon 24 sata reperfuzije, kofein je povećao mRNA koja kodira IL-1 β i TNF, bez promjene u sadržaju proteina; Suprotno tome, u 7 dana reperfuzije kofein je značajno smanjio razinu proteina IL-1 β i TNF. Nadalje, otkrili smo da unos kofeina različito utječe na reaktivnost mikroglije ovisno o vremenu reperfuzije, inhibirajući aktivaciju mikroglije u kasnijim vremenskim točkama nakon ozljede (7 dana reperfuzije). Značajno je da rezultati na mrežnici rekapituliraju prividne kratkotrajne i dugoročne učinke kofeina na reaktivnost mikroglije u parenhimu mozga u različitim vremenskim razdobljima nakon primjene različitih uvreda. Zabilježeno je da 10, 42, 43 primjena kofeina smanjuje broj reaktivnih mikroglija u parenhimu mozga nakon produljenog izlaganja 6-hidroksidopaminu 42 ili kronične infuzije lipopolisaharida (LPS). 10 Suprotno tome, kofein potencira strijatalnu aktivaciju mikroglije i astroglije izazvane 3, 4-metilendioksimetamfetaminom (MDMA), 43 iako je ovo procijenjeno samo 48 sati nakon primjene MDMA, što otvara mogućnost da kofein različito kontrolira reaktivnost mikroglije u kasnijim vremenskim točkama, Štoviše, ovo dalje navodi mikrogliju kao glavne pridonositelje povećanju upalnog odgovora, 8 što je najavljeno prijavljenom sposobnošću kofeina za suzbijanje protuupalnih posrednika izazvanih LPS, kao dušični oksid (NO), prostaglandin E2 i TNF u mišjim BV-2 mikroglijska stanična linija. 44

Povećana reaktivnost mikroglije i oslobađanje upalnih medijatora mogu dovesti do aktivacije apoptotskih putova koji doprinose patogenezi oštećenja mrežnice I-R. Smrt apoptotske ćelije rani je događaj u I-R modelu oštećenja otkriven u tri nuklearna sloja. 46 Nakon 24 sata reperfuzije, apoptotička stanična smrt bila je vidljivija u unutarnjem nuklearnom sloju (INL), dok je nakon 7 dana reperfuzije većina stanica podvrgnutih apoptozi bila smještena u vanjskom nuklearnom sloju (ONL). Nekoliko izvještaja pokazuje da konzumiranje umjerenih doza kofeina pruža zaštitu od štetnih stanja (pregledano u Gomes i sur. 30 ). Sadašnji rad otkrio je da kofein zapravo ima dvofazni utjecaj na kontrolu stanične smrti u mrežnici. Tijekom 24 sata reperfuzije, kofein je povećao smrt stanica povezanih s I-R, dok je u 7 dana reperfuzije kofein pružio zaštitu mrežnici. Ovaj bifazni učinak kofeina zabilježen je i na životinjskom modelu multiple skleroze: kofein pruža zaštitu samo u efektorskoj fazi bolesti, kada se dogodi degeneracija, a ne u početnoj fazi bolesti, što odgovara početnoj upali. 47 Uzimajući u obzir ta zapažanja, moglo bi se nagađati da bi taj dvofazni učinak kofeina mogao biti povezan s određenim utjecajem kofeina na signalne putove u mikroglijama koji su važni za rješavanje kronične upale. Specifični obrasci ekspresije gena javljaju se u mrežnici zbog ishemije i u različitim vremenskim točkama reperfuzije. 28 Vremenski ovisni učinci kofeina odražavaju različitu modulaciju kofeina na različite signalne događaje ili stanične procese tijekom reperfuzije da u konačnici pruže zaštitu mrežnici od I-R ozljeda. Štoviše, ne možemo odbaciti učinke metabolita kofeina na mrežnici. Kako se kofein brzo metabolizira u teofilin i paraksantin (glavni metaboliti u glodavaca unutar 120 min 14 ), moguće je da ti metaboliti mogu također doprinijeti neuroprotekciji, kao što je opisano za paraksantin u modelima Parkinsonove bolesti 48, 49 i teobromina u modelima Alzheimerova bolest. 50

Ukratko, ovaj rad pokazuje da učinak primjene kofeina u modelu štakora prolazne ishemije mrežnice ovisi o vremenu reperfuzije. Važno je da je naknadno procijenjena točka (7 dana reperfuzije) primjena kofeina pružila zaštitu mrežnici od prolaznih ishemijskih oštećenja, što sugerira da je pogoršana reaktivnost mikroglije u ranijoj točki presudna za rješavanje upale i kroničnog unosa kofeina blagotvorno djeluje na mrežnicu. Predlažemo da buduće studije potencijalnih neuroprotektivnih ciljeva lijekova uzmu u obzir nekoliko vremenskih točaka. Štoviše, također smo po prvi puta pokazali da selektivni A2AR antagonist (KW6002) koji se daje oralno ima terapeutski interes protiv prolazne ishemijske oštećenja mrežnice, što sugerira da se antagonist 2A R može dalje proučavati za upravljanje ishemijskim bolestima mrežnice ili neurodegenerativnim bolestima.

Materijali i metode

životinje

Štakori i štakora divljih vrsta (WT) i globalni miševi A2A R-KO C57BL / 6 smješteni su u kontroliranom okruženju (temperatura 21, 8 ± 0, 1 ° C temperature i 67, 6 ± 1, 6% relativna vlaga, 12 h svjetla / 12 h mraku ciklus) sa besplatnim pristupom hrani i vodi. Sve postupke koji uključuju životinje odobrio je Odbor za dobrobit životinja Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Coimbri, a provedeni su u skladu s smjernicama Europske zajednice za uporabu životinja u laboratoriju (2010/63 / EU), premještene na portugalski zakona iz 2013. (Decreto-Lei 113/2013) i bili su u dogovoru s izjavom Udruge za istraživanje vida i oftalmologiju za uporabu životinja.

Mjerenje IOP-a

IOP je mjeren bilateralno 3 dana u tjednu pomoću odskočnog tonometra posebno dizajniranog za glodare (Tonolab; Icare, Vantaa, Finska) između 13:00 i 16:00. Izvršeno je šest pouzdanih mjerenja u svakom oku, a interni softver stvorio je prosječna vrijednost nakon uklanjanja visokih i niskih očitanja. Za potrebe ove studije, generirani prosjek smatran je jednim čitanjem i prijavljen je kao IOP za to oko. Bazalne vrijednosti IOP uzimane su u tjedan dana prije početka primjene kofeina.

Davanje lijekova

Za ispitivanje terapijskog potencijala selektivnog antagonista A2A R, štakori su tretirani oralnim odvajanjem KW6002 (3 mg / kg), 2 sata nakon indukcije I-R i svakodnevno do kraja eksperimenta (Slika 7a ). Životinje su nasumično podijeljene na životinje tretirane s KW6002 (istradefilin, 3 mg / kg u otopini vehikla; sintetizirano kako je prethodno opisano 51 ) ili na životinje kojima je dana otopina u vozilu (0, 025% metilceluloza). Ispitivanje koje je uključivalo primjenu kofeina provedeno je korištenjem koncentracije (1 g / l) koja je ranije objavljena kako bi se postigla neuroprotekcija nakon ozljede CNS-a. 18, 23, 52 Kofein (1 g / l; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) isporučen je u pitkoj vodi 2 tjedna prije izazivanja ishemije i do kraja eksperimenta (slika 7b). Otopina kofeina pripremala se svježa svaka 2 dana. Životinje su nasumično podijeljene na pitku vodu ili kofein.

Image

Shematski pregled eksperimentalnog dizajna štakora. ( a ) Treatment with KW6002 (3 mg/kg) started (orally by gavage) 2 h after retinal ischemia (60 min), and once a day until the end of the experiment (7 days of reperfusion). The green line ( a ) or the blue line ( a and b ) indicate the reperfusion time. ( b ) Caffeine (1 g/l) was administered in the drinking water for 2 weeks prior induction of ischemia (60 min duration) and until the end of the experiment (24 h or 7 days of reperfusion)

Slika pune veličine

Retinal transient ischemic injury (I–R)

Retinal I–R injury was performed as we described previously. 5 Briefly, animals were anesthetized with 2.5% isoflurane (IsoFlo; Abbott Laboratories, Chicago, USA) in 1 l/min O 2, and placed on a heating plate to maintain their body temperature throughout the ischemic procedure. After topical anesthesia with oxybuprocaine (4 mg/ml, Anestocil, Edol) and pupillary dilation with tropicamide (10 mg/ml, Tropicil Top, Edol), the anterior chamber of one eye was cannulated with a 30-gauge needle (rats) or with a 33-gauge needle (mice) connected to a reservoir infusing sterile saline solution. Pressure in the eye was increased to 80 mm Hg (measured with Tonolab) for 60 min (rats) or 45 min (mice) and the contralateral eye was considered as control. To avoid corneal opacity, viscoelastic solution (2% Methocel; Dávi II-Farmacêutica SA, Barcarena, Portugal) was applied to both eyes. After 60 min of ischemia the needle was withdrawn and reperfusion was established. Fusidic acid ointment (10 mg/g, Fucithalmic; Leo Pharmaceutical, Ballerup, Denmark) was applied at the end of the experiment to prevent infection. Animals drinking caffeine (1 g/l) were killed at 24 h or 7 days of reperfusion, and animals treated with KW6002 (3 mg/kg), WT and A 2A R-KO mice were killed at 7 days of reperfusion.

Quantification of caffeine levels

In the serum, caffeine was quantified by high-performance liquid chromatography using a reverse-phase column (LiChro-CART 125 × 4 mm 2 LiChrospher 100 RP-18 (5 μ m) cartridge fitted into a ManuCART holder; Merck, Darmstadt, Germany) and a Gilson system equipped with a UV detector set at 274 nm, as described previously. 52 Serum samples were obtained after centrifugation of blood at 2000 × g for 15 min.

In the retina, caffeine concentration was determined by using a caffeine/pentoxifylline Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit (Neogen Corporation, Lansing, MI, USA), following the instructions provided by the manufacturer with some modifications, as follows. The retinas were homogenized in enzyme immunoassay buffer (EIA) provided with the kit and then were sonicated and centrifuged at 10 000 × g , at 4 °C for 5 min, and the supernatant was collected. The concentration of caffeine/pentoxifylline was determined using a standard curve prepared with a caffeine solution (0–600 ng/ml in EIA).

imunohistokemija

Animals were deeply anesthetized with an intraperitoneal injection of a solution of ketamine (90 mg/kg; Imalgene 1000) and xylazine (10 mg/kg; Ronpum 2%) and then transcardially perfused with phosphate-buffered saline (PBS, in mM: 137 NaCl, 2.7 KCl, 10 Na 2 HPO 4, 1.8 KH 2 PO 4 ; pH 7.4), followed by 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA). The eyes were enucleated and postfixed in 4% PFA for 1 h. Then, the cornea was carefully dissected out and the eyecup was fixed for an additional 1 h in 4% PFA. After washing in PBS, the tissue was cryopreserved in 15% sucrose in PBS for 1 h, followed by 30% sucrose in PBS for 1 h. The eyecups were embedded in tissue-freezing medium (optimal cutting temperature (oct); Shandon Cryomatrix (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)) with 30% of sucrose in PBS (1 : 1), and stored at −80 °C. The tissue was sectioned on a cryostat (Leica CM3050 S, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany) into 10 μ m thickness sections and mounted on Superfrost Plus glass slides (Menzel-Gläser; Thermo Scientific).

For immunohistochemistry, retinal sections were fixed with ice-cold acetone at −20 °C for 10 min, and then rehydrated in PBS two times until the removal of OCT. The tissue was permeabilized with 0.25% Triton X-100 in PBS for 30 min. The sections were blocked in 10% normal goat serum plus 1% bovine serum albumin (BSA) in PBS for 30 min at room temperature in a humidified environment. After washing with PBS, the sections were incubated overnight with the primary antibody (Table 2) prepared in 1% BSA in PBS at 4 °C, in a humidified environment. Then, the sections were rinsed with PBS followed by incubation with the corresponding secondary antibodies (Table 2), prepared in 1% BSA in PBS for 1 h at room temperature, in the dark. The sections were washed with PBS and then incubated with the nuclear dye 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), diluted 1 : 2000. The tissue was washed in PBS and mounted with Glycergel mounting medium.

Tablica pune veličine

TUNEL test

Cell death was detected with a TUNEL Assay Kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA) with fluorescein detection following the instructions provided by the manufacturer. The nuclei were counterstained with DAPI (1 : 2000). Sections were washed in PBS and mounted with Glycergel mounting medium.

Analiza slike

For the analysis of microglia reactivity, the preparations were observed with a confocal microscope (LSM 710; Zeiss, Oberkochen, Germany) on an Axio Observer Z1 using a Plan ApoChromat x20/0.8 objective. From each eye, four sections were used and six images per section were acquired. In each image, the number of cells immunoreactive to both MHC-II and Iba1 (MHC-II + Iba1 + ) was counted and expressed as a percentage of the total number of cells immunoreactive to Iba1 (Iba1 + ). Representative images were acquired using a EC Plan-Neofluar x40/1.30 Oil DIC M27 objective. Z-stacks images were acquired and merged using the maximum intensity projection mode of the Zeiss Software (Zen 2009; Zeiss).

For the quantification of cell death (TUNEL staining), the preparations were observed in a fluorescence microscope (Axio observer Z1), using a LD Plan-Neofluar x40/0.6 Korr Ph2 M27 objective. From each eye, four sections were analyzed and the number of TUNEL + cells was counted in the entire retinal section and normalized to the length of the respective section. Representative images were acquired with a confocal microscope (LSM 710; Zeiss) on an Axio Observer Z1 using a EC Plan-Neofluar x40/1.30 Oil DIC M27 objective. Z-stacks images were acquired as described above.

Real-time qPCR

Total RNA was extracted from rat retinas using Trizol reagent (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). RNA samples were dissolved in 16 μ l of RNase-free water. Total RNA concentration was determined using a NanoDrop ND1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). The quality of total RNA was determined (2100 Bioanalyser). The integrity of RNA, expressed as the RNA integrity number, was between 7.7 and 9.6, indicating high-quality, non-degraded RNA.

The amplification of cDNA from 1 μ g of total RNA was performed according to the instructions provided by the manufacturer (NZYTech, Lisbon, Portugal). The resultant cDNA was treated with RNAse-H for 20 min at 37 °C, and a 1 : 2 dilution was prepared for real-time qPCR analysis. All samples were stored at −20 °C until analysis.

Genomic DNA contamination was assessed with a conventional PCR for β -actin using intron-spanning primers (Table 3), as described previously. 53 SYBR-Green-based qPCR was performed using StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), as described previously, 5 with the following conditions: iTaq Universal SYBR-Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 200 nM primers (Table 3) and 2 μ l of 1:2 dilution cDNA, in a total volume of 20 μ l. Three candidate housekeeping genes ( Hprt1 , Ywhaz and Rho ) were evaluated using NormFinder (a Microsoft Excel Add-in), and Hprt1 was the most stable gene, and was used as the control gene. Ct values were converted to 'Relative quantification' using the 2 −ΔΔCt method described previously. 54

Tablica pune veličine

Quantification of TNF and IL-1 β protein levels by ELISA

Protein levels of IL-1 β and TNF in the retinas from Wistar rats, WT and A 2A R-KO mice were quantified using ELISA, according to the instructions provided by the manufacturer (Peprotech, Rocky Hill, CT, USA).

The retinas were dissected in ice-cold PBS, and then were homogenized in 20 mM imidazole-HCl, 100 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, supplemented with complete mini protease inhibitor cocktail tablets (Roche, Basel, Switzerland) and phosphatase inhibitors (10 mM NaF and 1 mM Na 3 VO 4 ). Then, samples were sonicated and centrifuged at 10 000 × g for 5 min at 4 °C. The supernatant was collected and stored at −80 °C until use. The protein concentration of each sample was determined by the bicinchoninic acid protein assay according to the manufacturer's instructions (Pierce Biotechnology, Waltham, MA, USA). The cytokine concentration of each sample was normalized to the total protein concentration. The results represent the ratio between the I–R-injured retina and the contralateral eye.

Statistička analiza

The results are presented as mean±standard error of the mean. Statistical analysis was performed with the Prism 5.03 Software for Windows (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). The normality of the data was assessed with Shapiro–Wilks and Kolmogorov–Smirnov normality tests. Accordingly, data were analyzed with nonparametric or parametric tests, as indicated in the figure legends. For the qPCR and ELISA analysis, the statistical differences between I–R and contralateral retinas were evaluated using a Wilcoxon's signed-rank test. Values of P <0.05 were considered statistically significant.

Publisher's Note:

Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na zahtjeve za jurisdikciju u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunske brojke

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)