Podešavanje pogoduje kalcifikacija vaskularnih glatkih mišića uzrokovana fosfatima kanonskim i nekanonskim aktiviranjem nfκb | stanična smrt i bolest

Podešavanje pogoduje kalcifikacija vaskularnih glatkih mišića uzrokovana fosfatima kanonskim i nekanonskim aktiviranjem nfκb | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Kalcifikacija
  • Stanična signalizacija
  • NF-kB

Sažetak

Vaskularna kalcifikacija (VC) povezana je s povećanom kardiovaskularnom smrtnošću tijekom starenja, kroničnom bubrežnom bolešću (CKD), dijabetes melitusom tipa 2 (T2DM) i aterosklerozom. TNF sličan induktor apoptoze (TWEAK) nedavno se pojavio kao novi biomarker za dijagnozu i prognozu kardiovaskularnih bolesti. Za TWEAK vezanje za njegov funkcionalni receptor Fn14 prijavljeno je da potiče nekoliko koraka napredovanja aterosklerotskog plaka. Međutim, trenutno nisu dostupne informacije o ulozi TWEAK / Fn14 u razvoju medialne kalcifikacije koja je vrlo česta u starenju, CKD i T2DM. Ovo je ispitivanje istraživalo uključenost TWEAK-a u kalcifikaciju ljudskih vaskularnih glatkih mišićnih stanica (h-VSMC) in vitro . Izvještavamo da TWEAK vezanje na Fn14 promiče kalcifikaciju h-VSMC-a izazvanu anorganskom fosfatom, pogoduje osteogenoj tranziciji h-VSMCs, smanjuje acta2 i myh11 i povećava bmp2 mRNA i tkivno nespecifičnu alkalnu fosfatazu (TNAP) i povećava aktivnost MMP9. Blokada kanonskog puta NF κ B smanjena je za 80% TWAAK prokalcifična svojstva i smanjuje osteogeni prijelaz, aktivnost TNAP-a i MMP9. Blokada nekanonske NF κ B signalizacije siRNA ciljajući RelB smanjila je za 20% TWEAK prokalcifične efekte i smanjila TWEAK-inducirani gubitak kontraktilnog fenotipa h-VSMCs i aktivnost MMP9, bez moduliranja bmp2 mRNA ili TNAP aktivnosti. Inhibicija ERK1 / 2 aktivacije inhibitorom MAPK kinaze nije utjecala na TWAAK prokalcifična svojstva. Naši rezultati sugeriraju da TWEAK / Fn14 izravno favorizira kalcifikaciju h-VSMC-a izazvanu anorganskim fosfatima aktiviranjem i kanonskih i nekanonskih NF κ B puta. S obzirom na dostupnost neutralizirajućih strategija protiv TWEAK-a, naša studija baca svjetlo na osi TWEAK / Fn14 kao novi terapeutski cilj u prevenciji VC-a.

Glavni

Vaskularna kalcifikacija karakterizira nakupljanje kalcijevih i fosfatnih soli unutar kardiovaskularnog sustava. VC se može razviti u intimu i medijima žila, kao i u srčanim zalistacima, a povezan je s povećanom kardiovaskularnom smrtnošću. 1 VC rezultat je neravnoteže između induktora kalcifikacije (npr., Poremećaji minerala, upale) i inhibitora (npr. Fetuin A, Matrix Gla protein, pirofosfat (PPi)). 2 Povećana razina anorganskog fosfata (Pi) ili Ca 2+, upala ili oštećenje krvožilnog sustava dovode do osteo-hondrogene pretvorbe stanica vaskularnih glatkih mišića (VSMC), rezidentnih fibroblasta ili intersticijskih ćelija u mirovanju, što novootkriva faktor transkripcije povezan sa runtom, tkivna nespecifična alkalna fosfataza (TNAP) i koštani morfogenetski protein 2 (BMP2). To je povezano s oslobađanjem prokalcifičnih matrica vezikusa i remodeliranjem izvanstanične matrice (sinteza kolagena tipa I i razgradnja elastina). Uz to, ovo prokalcifično okruženje potiče apoptozu vaskularnih stanica i oslobađanje apoptotičkih tijela koja su u stanju nukleatirati hidroksiapatit. 3

VC je vrlo rasprostranjen u starenju, kroničnoj bolesti bubrega (CKD), dijabetes melitusu tipa 2 (T2DM) i aterosklerozi. Starenje 4 i CKD 5 povezani su s kroničnom kroničnom sustavnom upalom i upala pogoršava bolesti povezane s dobi, poput ateroskleroze i T2DM. 6 Nedavna istraživanja pružila su uvjerljive dokaze da je VC povezan s upalom i pojačan je nekim upalnim citokinima. Međutim, precizni citokini i, prema tome, koji bi mogli biti terapeutski ciljevi, nisu na odgovarajući način okarakterizirani. Konkretno, neki članovi TNF super-porodice potiču Pi-inducirani VSMC osteogeni prijelaz i naknadnu kalcifikaciju. 7 TNF sličan induktor apoptoze (TWEAK) je TNF superfamili citokin koji se nedavno pojavio kao novi biomarker za dijagnozu i prognozu kardiovaskularnih bolesti. 8 TWEAK vezan membranom može se prerađivati ​​furinom u topljivi TWEAK (sTWEAK). 9 TWEAK vezanje molekula 14 (Fn14) koji inducira faktor rasta fibroblastnim faktorom rasta aktivira signalizaciju aktiviranu mitogenom protein kinazom (MAPK) i potiče NF κ B aktivaciju i kanonskim i nekanonskim putem. Kao posljedica toga, TWEAK regulira staničnu proliferaciju, migraciju, diferencijaciju, smrt, upalu, fibrozu i angiogenezu ovisan o staničnoj vrsti i mikro okruženju. 10, 11, 12, 13

TWEAK se izražava normalnim i patološkim stijenkama arterija. Iako TWEAK nakon povrede može biti reguliran, 15 promjena njegove ekspresije gena obično su umjerene. Suprotno tome, ekspresija Fn14 u zdravoj vaskulaturi obično je niska ili nije vidljiva. Međutim, brzo se i visoko regulira u patološkim uvjetima, kako je opisano u aneurizmu aorte i aterosklerotskim plakovima karotida, senzibilizirajući na TWEAK učinke. 14, 16 Podaci iz životinjskih modela govore da TWEAK / Fn14 doprinosi stvaranju aneurizme trbušne aorte. 17 Pored toga, osa TWEAK / Fn14 potiče nekoliko koraka razvoja aterosklerotskog plaka, uključujući inicijaciju, progresiju, destabilizaciju / ruptura i naknadnu trombozu. 8 Konkretno, kod ApoE KO miševa, anti-TWEAK tretman smanjio je upalu povezanu s napredovanjem aterosklerotskog plaka, uključujući posljednji korak kalcifikacije plaka. 18

Iako ovi podaci sugeriraju ulogu osi TWEAK / Fn14 u patofiziologiji intimalne kalcifikacije u aterosklerozi, nije jasno je li smanjena aterosklerotska kalcifikacija plaka kod miševa tretiranih anti TWEAK posljedica nižeg aterosklerotskog opterećenja ili izravnog učinka TWEAK-a na intimnoj kalcifikaciji. Nadalje, trenutno nisu dostupne informacije o ulozi TWEAK / Fn14 u medijalnoj kalcifikaciji, kako je uočeno u CKD-u i drugim uvjetima. Ova studija imala je za cilj procijeniti potencijal TWEAK-a za izravno promicanje humane VSMC (h-VSMC) kalcifikacije in vitro.

Rezultati

Osovina TWEAK / Fn14 favorizira kalcifikaciju uzrokovanu Pi i osteogeni prijelaz h-VSMCs

Da bi se istražila sposobnost TWEAK-a da modulira h-VSMC mineralizaciju, stanice su se inkubirale 7 dana u prokalcifičnim uvjetima (3 mmol / l Pi) u kombinaciji s povećanjem koncentracije TWEAK (1–200 ng / ml). U prisutnosti 3 mmol / l Pi, TWEAK je značajno povećao taloženje minerala na način ovisan o koncentraciji, što je procijenjeno Alizarin crvenim bojenjem (Slika 1a). TWEAK nije pokazao nikakav učinak na kalcifikaciju h-VSMCs kada Pi nije dodan u kulturni medij (dopunska slika S1). U daljnjim su pokusima korišteni 100 ng / ml TWEAK-a jer je najniža koncentracija TWEAK-a značajno pogodovala kalcifikaciji uzrokovanoj Pi-om, iako je uočen trend od 1 ng / ml. h-VSMC-i na održivost i proliferaciju nisu utjecali Pi ili TWEAK (dopunska slika S2). Smanjenje regulacije Fn14 siRNA (dopunska slika S3A) umanjilo je TWEAK učinke na Pi-induciranu kalcifikaciju u usporedbi s kodiranim transfektiranim stanicama (Slika 1b).

Image

TWEAK / Fn14 promiče kalcificiranje h-VSMC-a izazvano Pi putem aktiviranjem Fn14. ( a ) Učinak TWEAK-a na taloženje minerala izazvanim Pi (crveno obojenje Alizarinom). h-VSMCss uzgajali su 7 dana u prokalcifičnim uvjetima (3, 0 mmol / l Pi) u prisutnosti ili odsutnosti TWEAK-a (1–200 ng / ml) u mediju koji je sadržavao 1% FBS. Ljestvice: 500 μ m. * P <0, 05 i ** P <0, 01 u odnosu na stanice izložene 3, 0 mmol / l Pi, bez TWEAK-a. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Stupci pogrešaka predstavljaju SEM ( b ) Utjecaj smanjenja regulacije Fn14 na kalcifikaciju h-VSMC-a izazvanu TWEAK-om u prokalcifičnim uvjetima (bojenje Alizarinom). Ljestvice: 500 μ m. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Trake pogrešaka predstavljaju SEM NS, nisu značajne

Slika pune veličine

Da bismo razumjeli kako aktivacija osi TWEAK / Fn14 promovira pi-induciranu h-VSMC mineralizaciju in vitro , utjecaj TWEAK na h-VSMCs osteogeni prijelaz, aktivnost TNAP-a i aktivnost matrične metaloproteinaze (MMP) ocjenjivan je u obje ne-kalcifične (1.1. mmol / l Pi) i prokalcifični (3.0 mmol / l Pi) uvjeti. Podaci dobiveni qRT-PCR pokazali su da je 7-dnevna izloženost 100 ng / ml TWEAK-a smanjila za oko 70% ekspresiju kontraktilnih markera acta2 i myh11 u ne-kalcifičnim uvjetima (slike 2a i b) i značajno se pojačala za oko tri -kratko smanjenje uzrokovano Pi-om u oba kalkalna okruženja (slike 2a i b). Što se tiče h-VSMCs osteogene pretvorbe, TWEAK je porastao za 60% bmp2 mRNA ekspresiju u nekalcifičnom stanju i pokrenuo trostruko povećanje razine bmp2 mRNA u prokalcifičnim uvjetima (Slika 2c). TNAP hidrolizira PPi, snažni inhibitor taloženja kalcijevog fosfata i tako potiče kalcifikaciju. 19 U ne-prokalcifičnim uvjetima, 7-dnevni TWEAK porastao je za 25% TNAP ekspresije (dopunska slika S4), što je rezultiralo povećanjem za 40 i 120% TNAP aktivnosti (Slika 2d). U vaskulaturi, MMP2 i MMP9 ubrzavaju razgradnju elastina i potiču kalcifikaciju. U našem modelu, TWEAK nije modulirao niti MMP2 mRNA ekspresiju (Slika 3a) niti njegovu aktivnost (Slika 3c), već je značajno povećao i MMP9 mRNA ekspresiju (Slika 3b), kao i aktivnost (Slika 3c) u ne-kalcifičnim uvjetima.

Image

TWEAK / Fn14 potiče h-VSMC osteogeni prijelaz. Učinci TWEAK-a (100 ng / ml, 7 dana) procijenjeni su u ne-kalcifičnim (Ct: 1, 1 mmol / l Pi) i pro-kalcifičnim (Pi: 3, 0 mmol / l Pi) uvjetima. ( a - c ) Učinci TWEAK-a na ekspresiju acta2 ( a ), myh11 ( b ) i bmp2 ( c ) mRNA, procijenjeni kvantitativnom reverznom transkriptazom-PCR. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 u odnosu na stanice izložene 1, 1 mmol / l Pi, bez TWEAK-a. $ P <0, 05, $$ P <0, 01, $$$ P <0, 001 u odnosu na stanice izložene 3, 0 mmol / l Pi, bez TWEAK-a. P <0, 05, †kantang P <0, 001 u odnosu na stanice izložene 1, 1 mmol / l Pi s TWEAK-om. Rezultati predstavljaju najmanje tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Stupci pogrešaka predstavljaju SEM ( d ) Učinke TWEAK-a na TNAP aktivnost procjenjujući analizom PNPP fosfataze. * P <0, 05, ** P <0, 01 u odnosu na stanice izložene 1, 1 mmol / l Pi, bez TWEAK-a. $ P <0, 05 u odnosu na stanice izložene 3, 0 mmol / l Pi bez TWEAK-a. † P <0, 05 u odnosu na stanice izložene 1, 1 mmol / l Pi s TWEAK-om. Rezultati predstavljaju pet neovisnih eksperimenata izvedenih u tri primjerka. Trake pogrešaka predstavljaju SEM

Slika pune veličine

Image

TWEAK / Fn14 potiče aktivnost MMP9, ali ne i MMP2. ( a i b ) Učinci TWEAK-a na mmp2 ( a ) i mmp9 ( b ) mRNA ekspresiju procijenjeni kvantitativnom reverznom transkriptazom-PCR. ** P <0, 01 u odnosu na stanice izložene 1, 1 mM Pi, bez TWEAK-a. $$$ P <0, 001 u odnosu na stanice izložene 3.0 mmol / l Pi, bez TWEAK-a. Rezultati predstavljaju najmanje tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Stupci pogrešaka predstavljaju SEM ( c ) Učinci TWEAK-a na aktivnost MMP2 i MMP9 u h-VSMC supernatantima, ocjenjivanom gel zimografijom. ** P <0, 01, *** P <0, 001 u odnosu na stanice izložene 1, 1 mM Pi, bez TWEAK-a. $$$ P <0, 001 u odnosu na stanice izložene 3.0 mmol / l Pi, bez TWEAK-a. †Kan P <0, 01 u odnosu na stanice izložene 1, 1 mmol / l Pi s TWEAK-om. Rezultati predstavljaju najmanje tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Trake pogrešaka predstavljaju SEM NS, nisu značajne

Slika pune veličine

U stanicama bubrežnih tubula, makrofazima i bubrežnom tkivu, ERK angažman i kanonična, kao i nekanonična NF κ B aktivacija doprinose TWEAK upalnim učincima. 10, 12, 20, 21 Kako bi se identificirali intracelularni putevi odgovorni za TWAAK / Fn14 pro-kalcifične učinke, signalizacija TWEAK je blokirana pomoću inhibitora male molekule ili siRNA. Kako je apoptoza ključni induktor kalcifikacije h-VSMCs, osigurali smo da koncentracije inhibitora korištene za blokiranje kalcifikacije izazvane TWEAK-om h-VSMCs nisu modulirale staničnu vitalnost tokom 7 dana liječenja (dopunska slika S5A).

TWEAK / Fn14-inducirana MAPK aktivacija nije uključena u TWEAK pro-kalcifične učinke

U h-VSMCss, TWEAK favorizira ERK fosforilaciju na način ovisan o vremenu, s vrhom nakon 10 minuta stimulacije (dopunska slika S6A). Transfekcija Fn14 siRNA potpuno je ukinula TWEAK-induciranu ERK fosforilaciju u usporedbi s kodiranim transfektiranim stanicama (dopunska slika S6B). Kronična izloženost 10 μ mol / l U0126, selektivnom inhibitoru MAPK kinaza MEK1 i MEK2, inhibira TWEAK-induciranu ERK fosforilaciju (dopunska slika S6C), ali nije modulirala TWEAK pro-kalcifičke učinke na Pi-induciranu h-VSMCs mineralizaciju u usporedbi s h-VSMC koji nisu izloženi U0126 (dopunska slika S6D).

TWEAK / Fn14-inducirana kanonska NF κ B aktivacija pogoduje kalcificiranju h-VSMC-a induciranog Pi-om promičući osteogeni prijelaz, aktivnost TNAP-a i MMP9 aktivnost

Fosforilacija i naknadna proteasomska razgradnja I κ B znak su klasične aktivacije NF κ B puta koja olakšava oslobađanje p65 (RelA) / p50 dimera, koji zatim migriraju do jezgre radi moduliranja ekspresije protuupalnog gena. Dodatna fosforilacija RelA na Ser536 bitna je za transaktivaciju gena. U h-VSMCss, TWEAK je inducirao RelA nuklearnu translokaciju i naknadnu fosforilaciju na vremenski ovisan način, dostižući maksimum 10 minuta (dopunske slike S7A i C). Eksperimenti gubitka funkcije pomoću siRNA protiv Fn14 ukinuli su TWEAK-induciranu RelA nuklearnu translokaciju i naknadnu fosforilaciju u usporedbi s kodiranim transfektiranim stanicama (dopunske slike S7B i D). Transfekcija siRNA s RelA, koja je smanjena za 75% ekspresije RelA u h-VSMCss (dopunska slika S8A) i ukinula RelA fosforilaciju (dopunska slika S8B), značajno smanjena za 80% TWEAK povećavanje kalificiranja izazvanog Pi u usporedbi s kodiranim transfeciranim ćelije (slika 4a). U prokalcifičnim uvjetima, RelA siRNA spriječila je za 60 i 50%, TWEAK-inducirano smanjenje ekspresije acta2 i myh11 mRNA (Slike 4b i c). Od interesa, RelA ciljanje potpuno je ukinulo TWEAK-inducirano povećanje ekspresije bmp2 mRNA (slika 4d), TNAP aktivnosti (slika 5a) i MMP9 mRNA ekspresiju (slika 5b) i aktivnost (slika 5c) u usporedbi s kodiranim transfektiranim stanicama.

Image

TWEAK / Fn14-inducirana kanonska NF κ B aktivacija pogoduje kalcificiranju h-VSMC-a izazvanom Pi-om promičući osteogeni prijelaz. h-VSMCss transficirani su bilo kodiranom ili RelA siRNA i bili izloženi 7 dana ili nisu bili izloženi TWEAK-u u prokalcifičnim uvjetima (3.0 mmol / l Pi). ( a ) Utjecaj smanjenja regulacije RelA na kalcifikaciju h-VSMC-a izazvanu TWEAK / Fn14 u pro-kalcifičnim uvjetima (3, 0 mmol / l Pi). Mineralizacija je mjerena Alizarinovim crvenim obojenjem. Ljestvice: 500µm. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. $ P <0, 05 u odnosu na RelA siRNA transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Stupci pogrešaka predstavljaju SEM ( b - d ) utjecaj smanjenja regulacije RelA na TWEAK-induciranu modulaciju akta2 ( b ), myh11 ( c ) i bmp2 ( d ) mRNA ekspresije, ocjenjivanom kvantitativnom reverznom transkriptazom-PCR. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. $ P <0, 05 u odnosu na RelA siRNA transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Trake pogrešaka predstavljaju SEM NS, nisu značajne

Slika pune veličine

Image

KANONSKO NF κ B aktiviranje izazvano TWEAK / Fn14 pogoduje aktivnosti TNAP i MMP9. h-VSMCss transficirani su bilo kodiranom ili RelA siRNA i bili izloženi 7 dana ili nisu bili izloženi TWEAK-u u prokalcifičnim uvjetima (3.0 mmol / l Pi). ( a ) Utjecaj smanjenja regulacije RelA na TWEAK-modulaciju aktivnosti TNAP-a. Aktivnost TNAP-a procijenjena je ispitivanjem pNPP fosfataze. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Stupnjevi pogrešaka predstavljaju SEM ( b ) Utjecaj smanjenja regulacije RelA na ekspresiju mRN9 izazvane TWEAK-om procijenjenu kvantitativnom reverznom transkriptazom-PCR. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Stupci pogrešaka predstavljaju SEM ( c ) Utjecaj smanjenja regulacije RelA na TWEAK-induciranu MMP9 aktivnost, procijenjen gelometrografijom na supernatantu stanice. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Trake pogrešaka predstavljaju SEM NS, nisu značajne

Slika pune veličine

Ne-kanonska aktivacija NF κ B izazvana TWEAK / Fn14 potiče gubitak h-VSMC kontraktilnog fenotipa, kao i MMP9 aktivnost, ali ne modulira niti bmp2 ekspresiju niti TNAP aktivnost

Aktivacija nekanonskog puta NF κ B karakterizira obrada NF κ B2 p100 u NF κ B p52. To rezultira u stvaranju p52 / RelB heterodimera s transkripcijskim regulatornim djelovanjem. U h-VSMCss, TWEAK je smanjio p100 i povećao p52 na vrijeme ovisan o vremenu (dopunska slika S9A). Međutim, kao i u ostalim tipovima stanica, TNF- α nije aktivirao nekanonski NF κ B put (dopunska slika S10). 20 Eksperimenti s gubitkom funkcije pomoću siRNA protiv Fn14 ukinuli su TWEAK-induciranu obradu p100 u usporedbi s kodiranim transficiranim stanicama (dopunska slika S9B). Transfekcija siRNA ciljajući RelB, koja je smanjena za 80% RelB ekspresije (dopunska slika S11A) i blokirala TWEAK-induciranu ekspresiju nekanonskog ciljanog gena NF κ B CCL21 (dopunska slika S11B), smanjena je za 20% efekte TWEAK-a na Pi-induciranoj kalcifikaciji u usporedbi s kodiranim transfektiranim stanicama (Slika 6a). U prokalcifičnim uvjetima, snižavanje regulacije RelB spriječeno je za 50 i 25%, TWEAK-inducirano smanjivanje ekspresije acta2 i myh11 mRNA (slike 6b i c), ali nije moduliralo uregulaciju mRNA-inducirane bmp2 mRNA (slika 6d) ili TNAP aktivnost (Slika 7a). Od interesa, RelB ciljanje značajno je smanjilo TWEAK-induciranu MMP9 mRNA ekspresiju (Slika 7b) i smanjilo MMP9 aktivnost (Slika 7c).

Image

Ne-kanonska aktivacija NF κ B izazvana s TWEAK / Fn14 potiče gubitak h-VSMC kontraktilnog fenotipa, ali ne modulira bmp2 ekspresiju. h-VSMCss transficirani su bilo kodiranom ili RelB siRNA i izloženi 7 dana ili nisu izloženi TWEAK-u u prokalcifičnim uvjetima (3, 0 mmol / l Pi). ( a ) Utjecaj smanjenja regulacije RelB-a na kalcifikaciju h-VSMC-a, izazvanu TWEAK / Fn14. Mineralizacija je mjerena Alizarinovim crvenim obojenjem. Ljestvice: 500 μ m. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. $ P <0, 05 u odnosu na stanice transficirane RelA siRNA i nisu izložene TWEAK-u. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Stupci pogrešaka predstavljaju SEM ( b - d ) utjecaj smanjenja regulacije RelB na TWEAK-induciranu modulaciju akta2 ( b ), myh11 ( c ) i bmp2 ( d ) mRNA ekspresije, ocjenjujući kvantitativnom reverznom transkriptazom-PCR. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. $ P <0, 05 u odnosu na siRNA RelB transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Trake pogrešaka predstavljaju SEM NS, nisu značajne

Slika pune veličine

Image

Ne-kanonska NF κ B aktivacija izazvana TWEAK / Fn14 ne utječe na TNAP aktivnost, već pogoduje mmp9 aktivnosti. h-VSMCss transficirani su bilo kodiranom ili RelB siRNA i izloženi 7 dana ili nisu izloženi TWEAK-u u prokalcifičnim uvjetima (3, 0 mmol / l Pi). ( a ) Utjecaj smanjenja regulacije RelB-a na TWEAK-induciranu modulaciju aktivnosti TNAP-a. Aktivnost TNAP-a procijenjena je ispitivanjem pNPP fosfataze. ** P <0, 01 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. $$ P <0, 05 u odnosu na stanice transficirane siRNA RelB i nisu izložene TWEAK-u. Stupci pogrešaka predstavljaju SEM ( b ) Utjecaj smanjenja regulacije RelB na ekspresiju mRN9-inducirane mRNA izražene TWEAK-om procijenjene kvantitativnom reverznom transkriptazom-PCR. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. $ P <0, 05 u odnosu na siRNA RelB transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Stupci pogrešaka predstavljaju SEM ( c ) Utjecaj smanjenja regulacije RelB-a na TWEAK-induciranu MMP9 aktivnost ocijenjenu gel-zimografijom u h-VSMCs supernatantima. * P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice bez TWEAK-a. P <0, 05 u odnosu na kodirane transficirane stanice izložene TWEAK-u. Rezultati predstavljaju tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. Trake pogrešaka predstavljaju SEM NS, nisu značajne

Slika pune veličine

TWEAK pojačava Fn14 izraz u h-VSMCss

Iako se Fn14 ingulira in vivo u situacijama staničnog ili tkivnog stresa, mehanizmi se slabo razumiju. Ekspresija Fn14 je regulirana nakon 7 dana izlaganja TWEAK-u, i u ne-kalcifičnim uvjetima (dopunska slika S12A). Kanonska, ali ne nekanonska, aktivacija NF κ B uključena je u regulaciju ekspresije Fn14 kao odgovor na TWEAK (dopunska slika S12B).

Rasprava

Glavni nalaz je da upalni citokin TWEAK izravno potiče kalcifikaciju h-VSMC-a pomoću Fn14 zahvata i kanonske i nekanonske NF κ B signalizacije. Kronična sistemska upala niske razine česta je kod starenja, T2DM i CKD-a te je povezana s povećanom prevalencijom, ozbiljnošću i napredovanjem VC-a i povećanom smrtnošću. 22, 23, 24 TWEAK promiče ozljede kardiovaskularnog sustava i bubrega u pokusnim životinjskim modelima. 25, 26, 27 Smanjena razina sTWEAK u cirkulaciji povezana je s koronarnom arterijskom bolešću, 28 sistoličkim zatajenjem srca, 29 oboljenjem perifernih arterija 30 i aneurizmom trbušne aorte 16 i predviđaju ozbiljnost ateroskleroze. Smanjenje sTWEAK-a povezano je s brzom i visokom regulacijom TWEAK funkcionalnog receptora Fn14, 14, 16 za koji se misli da pojačava sTWEAK lokalno djelovanje unutar kardiovaskularnih tkiva. Koncentracija sTWEAK u cirkulaciji smanjuje se u krajnjoj fazi bubrežne bolesti i T2DM. 32 Međutim, više sTWEAK razine pronađene su kod osoba s hemodijalizom s težom kalcifikacijom nego u osoba s ne-ozbiljnom kalcifikacijom 33 i viša razina TWEAK-a povezana su s većim rizikom od uzroka i kardiovaskularne smrtnosti, 34 sugerirajući vezu između sTWEAK-a i VC-a.

Iako je uloga TWEAK-a u aterosklerozi opsežno okarakterizirana, nema podataka o ulozi TWEAK-a u medijalnoj kalcifikaciji, što je znak CKD-a i T2DM. Naše istraživanje pokazalo je da TWEAK izravno favorizira kalcifikaciju h-VSMC-a izazvanu Pi-om in vitro i podupire ulogu TWEAK-a u VC-u osim što pogoduje aterosklerozi. TWEAK pojačan Pi-inducirani gubitak kontraktilnih markera i stjecanje osteogenih markera, sugerirajući da TWEAK povećava kalcifikaciju in vitro favorizirajući ostegenu tranziciju izazvanu h-VSMCs. Nadalje, TWEAK je povećao ekspresiju i aktivnost TNAP-a i u ne-kalcifičnim uvjetima. TNAP hidrolizira PPi, VC inhibitor, i stvara Pi, što je bitno za stvaranje hidroksiapatita. Degradirajući PPi, TNAP promiče kalcifikaciju, mijenjajući omjer Pi / PPi u smjeru mineralizacije. 35 Od interesa, za razliku od TNF- a , 36 TWEAK nije inducirao h-VSMC kalcifikaciju u odsustvu visoko fosfatnog medija (dopunska slika S1), iako je on inducirao osteogenski prijelaz, aktivnost TNAP-a i MMP9 u ne-kalcifičnom stanju.

Poznato je da mnogi pro-kalcifični agensi potiču mineralizaciju h-VSMC-a kroz izlučivanje pro-kalcifične matrice bogate kolagenom tipa I. U životinjskim modelima TWEAK potiče fibrozu. 13, 37 U ovom radu, 7-dnevna izloženost TWEAK-u značajno je smanjila ekspresiju kolagena tipa I i na razini mRNA i proteina (dopunska slika S13), sugerirajući da TWEAK prokalcifični efekti ne ovise o izlučivanju pro -kalcifična matrica. Ti su podaci u skladu s nedavnim izvještajem iz naše skupine koji je pokazao smanjenu ekspresiju kolagena tipa I u fibroblastima uzgojenim in vitro u prisutnosti TWEAK-a. 13 U ovom radu, autori su pokazali da su profibrotski učinci TWEAK-a uočeni in vivo posljedica proliferacije fibroblasta izazvane TWEAK-om, a ne sinteze kolagena.

TWEAK vezanje na Fn14 pokreće regrutovanje TRAF2 i TRAF5, čime se aktiviraju signalni putevi, poput MAPK i NF κ B. 38, 39 MAPK i NF κ B signalizacije, uključeni u TNF- α- induciranu VSMC kalcifikaciju u visoko-fosfatnom mediju. 40, 41 U ovom radu, TWEAK vezanje za Fn14 inducirano je MAPK signalizacijom putem ERK fosforilacije. Međutim, inhibicija fosforilacije ERK1 / 2 nije utjecala na prokalcifične učinke TWEAK-a, podvlačeći razlike u mehanizmima kojima TNF- a i TWEAK favoriziraju kalcifikaciju VSMC-a. U nekoliko tipova stanica TWEAK aktivira i kanoničnu NF κ B signalizaciju, kratkotrajni odgovor koji rezultira nuklearnom migracijom kompleksa koji sadrži p65 (RelA) i dugotrajniji nekanonski put koji rezultira nuklearnom migracijom NF κ B2 p52 / RelB -sastavni kompleksi. 20, 39, 42 U našem modelu, aktiviranje Fn14 od strane TWEAK-a uključivalo je i kanonske i nekanonske NF κ B staze. Blokada kanonske NFκB aktivacije siRNA značajno je smanjila TWEAK-inducirane h-VSMCs osteogeni prijelaz i aktivnost TNAP-a, što je za 80% smanjilo njegove pro-kalcifične učinke. Ovi učinci slični su učincima TNF- a , koji je promovirao ostegenu tranziciju VSMC i aktivnost TNAP-a kroz kanoničnu NF κ B aktivaciju. 43, 44, 45, 46 Blokiranje nekanonične NFκB putanje siRNA značajno je smanjilo TWEAK-inducirani gubitak h-VSMC kontraktilnog fenotipa, ali nije utjecalo na TWEAK-induciranu bmp2 ekspresiju ili TNAP aktivnost i smanjeno za 20% TWEAK pro-kalcifiku učinke. U tom pogledu, TWEAK akcije se razlikuju od onih TNF- α , kao što je to slučaj i u našem modelu, kao i kod ostalih tipova stanica, TNF- α ne aktivira nekanonski NF κ B put (Dopunska slika S10). 20 Nadalje, u našem modelu kalcifikacija inducirana Pi-om ili TWEAK-ovo povećanje kalcifikacije nije ovisilo o h-VSMCs apoptozi. Suprotno tome, prijavljeno je da TNF- a favorizuje Pi-induciranu VSMC apoptozu i naknadnu kalcifikaciju. 47 U tom pogledu, Fn14 receptoru nedostaje domena smrti karakteristična za superfamilu TNF receptora. Stoga se čini da se molekularni mehanizmi TWOAK-inducirane apoptoze razlikuju od onih TNF- a .

Razgradnja vaskularnog elastina povećava afinitet vanćelijskog matriksa za kalcij, 48 olakšavajući epitaktički rast hidroksiapatita duž elastičnih lamela. MMP2 i MMP9 imaju ključnu ulogu u ovom procesu, jer su miševi MMP-2 - / - i MMP-9 - / - bili otporni na razgradnju elastina i kalcifikaciju. 49 Proupalni citokini, poput TNF- α 50 i IL-1 β , 51, snažni su induktori MMP aktivnosti u kardiovaskularnom sustavu. U ovom radu, dugotrajna izloženost TWEAK-u pogodovala je izrazu i aktivnosti MMP9, ali ne i o MMP2. Ovi rezultati su u skladu s nedavnim izvješćem koje pokazuje veći poremećaj elastičnog sloja i pojačanu MMP aktivnost u aortama WT miševa nego u onima iz TWEAK - / - ili Fn14 - / - miševa. 17 U našem modelu, h-VSMCss uzgajao se u 2D sustavu bez elastina, tako da prokalcifični učinci TWEAK-a primijećeni in vitro ne mogu biti izravna posljedica povećane aktivnosti MMP9. Međutim, ovi podaci sugeriraju da in vivo sTWEAK može povećati aktivnost vaskularnog MMP9 i tako pokrenuti VC u normalnim fosfatnim uvjetima ili pogoršati VC potaknut hiperfosfatemijom, kao što je uočeno kod CKD.

U zdravim tkivima ekspresija Fn14 obično je niska ili se ne može prepoznati, mada se brzo i jako regulira u patološkim uvjetima, poput infarkta miokarda, 52 restenoze nakon ozljede balona 53 ili ateroskleroze. 14 U stanicama oštećenih vaskularnih zidova 14, 53, 54 Fn14 reguliraju citokini, kao što su TNF- α , IL1- β i IFN- y . U ovom istraživanju, ekspresiju Fn14 regulirao je TWEAK i u ne-kalcifičnim uvjetima, što bi moglo pojačati TWEAK pro-kalcifična svojstva. Malo se zna što se tiče regulacije ekspresije Fn14, a samo je RhoA / ROCK put povezan s povećanjem Fn14 u kardiomiocitima i h-VSMC. 14, 55 Po našem prvom saznanju, izvješćujemo da kanonska, ali ne nekanonska, aktivacija NF κ B potiče ekspresiju Fn14 u h-VSMCss izloženom TWEAK-u.

Prethodno izvješće našeg tima pokazalo je da se TWEAK izražava i u makrofazima i u glatkim mišićnim stanicama unutar karotidnih aterosklerotskih plakova. 14 Potvrđujući ove podatke, u našem modelu TWEAK konstitutivno izražava primarni h-VSMCss (dopunska slika S14A). Međutim, tijekom procesa mineralizacije nije moduliran ni od strane Pi, niti od samog TWEAK-a (dopunska slika S14B), što sugerira da u našem modelu TWEAK pro-kalcifični učinci nisu povezani s povećanom sekrecijom autokrinog TWEAK-a u h-VSMCss.

Uz to, aktiviranje NF κ B uzrokovano TWEAK-om in vivo regulira nekoliko citokina uključenih u regrutni regrutovanje stanica na oštećene stijenke suda kao što su MCP-1 i RANTES, 56 što može povećati izravne pro-kalcifične učinke. Osim toga, u uzgojenim monocitima, TWEAK povećava HMGB1, 21 što veže i RAGE i TLR4 da lokalno posreduje visoku glukozu izazvanu kalcifikaciju VSMC. 57 Stoga se može razmotriti in vivo doprinos TWEAK-a induciranog HMGB1 u VC-u povezanom sa T2DM. Konačno, TWEAK smanjuje ekspresiju Klothoa u bubrezima i miševe sa nedostatkom Klothoa prikazuje VC. 58

Zaključno, kanonska NF κ B aktivacija izazvana TWEAK / Fn14 izravno pogoduje Pi-induciranom osteogenom prijelazu i TNAP aktivnosti, promičući kalcificiranu h-VSMC kalcije. Gubitak h-VSMC kontraktilnih markera kao posljedica nekanonske NF κ B inducirane TWEAK / Fn14 pojačava ovaj fenomen (Slika 8). Koliko znamo, ovo je prvo izvješće o izravnom prokalcifičnom učinku TWEAK-a i o nekanonskoj uključenosti NF κ B staze na medijalnu kalcifikaciju. Pored toga, TWEAK regulacija aktivnosti MMP-a i protuupalna sekrecija citokina, zajedno sa pro-aterogenim svojstvima, čine TWEAK potencijalnim snažnim induktorom i intimne i medijalne kalcifikacije. S obzirom na dostupnost neutralizirajućih strategija protiv TWEAK-a, ovo djelo osvjetljava TWEAK kao potencijalni novi terapeutski cilj za sprečavanje VC-a. Daljnje studije in vivo na patološkim životinjskim modelima trenutno se razmatraju kako bi se procijenile posljedice neutralizacije anti-TWEAK strategije na VC izazvane uremijom.

Image

TWEAK / Fn14 pro-kalcifični efekti na kalcifikaciju h-VSMC-a inducirane pi-om in vitro : shematski prikaz. U pro-kalcifičnim uvjetima, TWEAK / Fn14 kanonična NF κ B aktivacija promovirala je osteogeni prijelaz h-VSMCs, karakteriziran gubitkom kontraktilnih markera h-VSMCs acta2 i myh11 i uregulacijom osteogenog markera bmp2, snažnim aktivatorom TNAP-a. To je povezano s povećanjem aktivnosti TNAP-a, što degradira inhibitor kalcifikacije PPi da bi se oslobodio Pi koji je neophodan za stvaranje hidroksiapatita. KANONIČKA NF κ B-inducirana TWEAK / Fn14 također je povećala ekspresiju Fn14, što bi moglo pojačati TWEAK pro-kalcifična svojstva. I kanonska i nekanonska NF κ B aktivacija promovirala je aktivnost MMP9, što pogoduje razgradnji elastina in vivo . Ne-kanonična NF κ B aktivacija izazvana TWEAK / Fn14 pogoduje gubitku kontraktilnog fenotipa h-VSMC. Suprotno tome, nekanonska NF κ B aktivacija nije modulirala niti bmp2 ekspresiju niti TNAP aktivnost niti Fn14 ekspresiju

Slika pune veličine

Materijali i metode

VSMC humani (h-VSMC)

H-VSMC izolirani su iz segmenata proksimalnih uzlaznih aorta bez lezije modificiranom eksplicitnom metodom. 59 Uzorci su uzeti nakon operacije aortnog zaliska. Pacijenti su davali informirani pismeni pristanak u skladu sa španjolskim zakonodavstvom (PROTOCOL EO34 / 2013). Studija je sukladna Helsinškoj deklaraciji.

Analiza mineralizacije

Mineralizacija h-VSMCss (15000 ćelija / jažici, pločice sa 24 jažice) inducirana je 7 dana izlaganjem DMEM-u koji je dodavao 1% DMS koji sadrži 3.0 mmol / l Pi (prokalcifično stanje) ili 1.1 mmol / l Pi (ne -kalcifično stanje). Povećavajuće koncentracije rekombinantnog humanog TWEAK-a (1–200ng / ml, Millipore, Bedford, MA, SAD) dodane su kulturi i procijenjena mineralizacija izazvana Pi-om. Polovica kulture kulture obnavljala se svaka 2 dana. Otkrivanje i kvantifikacija taloženja minerala provedena je pomoću Alizarin Red obojenja. Ukratko, uzorci su fiksirani (50% etanol 5 min, 95% etanol 5 min), obojeni tokom 5 minuta s Alizarin crvenim S (40 mmol / l, pH 4, 2), isprani sa 50% etanolom i fotografirani. Alizarin crveni je zatim solubiliziran inkubacijom u puferu koji je sadržavao 10 mmol / l NaH2P03 i 10% heksadecil- piridin- klorid monohidrata prije očitanja na 570 nm. Kad je ocijenjena mineralizacija transfektiranim h-VSMCss, transfekcije su izvedene 24 sata prije i 96 sati nakon prvog izlaganja liječenju koje zanima. Za eksperimente upotrebe 10 μ mol / l U0126, inhibitor se dodaje svaka 2 dana svježim medijem.

h-VSMC transfekcija

h-VSMC transfektirani su siRNA razrijeđenom u OptiMEM (Gibco, Carlsbad, CA, SAD), koristeći lipofektamin (Invitrogen, Paisley, UK). siRNA ciljana Fn14, RelA i RelB (Invitrogen) korišteni su u koncentraciji od 10, 50 i 20 nM. Jastučna siRNA (Ambion, Foster City, Kalifornija, SAD) poslužila je kao negativna kontrola.

QRT-PCR

Ukupna RNA ekstrahirana je TRI reagensom metodom (Sigma, St Louis, MO, USA). Zatim je 1 μg RNA prepisana u cDNA pomoću „Kit za obrnutu transkripciju cDNA visokog kapaciteta“ (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD) prema uputama proizvođača. Unaprijed razvijeni temeljni premaz za acta2, myh11, bmp2, spp1, mmp2, mmp9, tnfsf12 i GAPDH bili su iz primijenjenih biosustava. Kvantitativni PCR izvršen je 7500 PCR sustavom u stvarnom vremenu sa sustavom SDS Prizm 7000 System Software (Applied Biosystems) i RNA ekspresija različitih gena korigirana je za GAPDH.

Western blotting

H-VSMC (60 000 stanica / jamici u pločama sa šest jažica) stimulirani su s Pi i / ili TWEAK. Uzorci su zatim homogenizirani u puferu za lizu (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0, 2% Triton X-100, 0, 3% NP-40, 0, 1 mM PMSF i 1 μg / ml pepstatina A ) i razdvojeno 10–12% SDS-PAGE pod smanjenim uvjetima. Nakon elektroforeze, uzorci su preneseni na PVDF membrane (Millipore), blokirani s 5% obranog mlijeka u PBS / 0, 5% v / v Tween 20 sati, isprani PBS / Tweenom i inkubirani preko noći na 4 ° C mišjim monoklonskim anti- ERK fosforilirani (1: 250), poliklonski zečji anti-ERK2 (1/250), poliklonski zečji anti-p65 (RelA) (1/500), poliklonski zečji anti-RelB (1/500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD), zečji monoklonski antifosfo-NF κ B p65 (1: 500), poliklonski zečji anti-Fn14 (1: 1000), poliklonski zec anti-NF κ B p52 / p100 (1: 1000) (stanica Signaling, Danvers, MA, SAD) ili zečje poliklonalno anti-TNAP (1: 500) (Abcam, Cambridge, Velika Britanija). Antitijela su razrijeđena u 5% mlijeku PBS / Tween. Blats su isprani s PBS / Tween i inkubirani s odgovarajućim sekundarnim antitijelom konjugiranim peroksidazom iz hrena (1: 2000, Amersham, Aylesbury, UK). Nakon ispiranja s PBS / Tween-om, mrljice su razvijene hemiluminescencijskom metodom (ECL) (Amersham, Aylesbury, Velika Britanija), a zatim se sonirale s mišjim monoklonskim anti- α -bubulinskim antitijelom (1: 2000, Sigma) ili mišjim monoklonskim anti-GAPDH protutijelima. (1: 3000, Millipore) slijedeći istu metodu i razine ekspresije ispravljene su zbog manjih razlika u opterećenju.

Konfokalna mikroskopija

H-VSMC monoplasti na poklopcima su fiksirani u 4% paraformaldehidu 10 minuta i ugašeni u 100 mmol / l glicin / PBS dodatnih 10 min. Stanice su zatim permealizirane u 0, 2% Triton X-100 / PBS tijekom 10 minuta. Nespecifično vezivanje blokirano je 30 minuta inkubacijom u 1% BSA / PBS. Kasnije su h-VSMCss inkubirali zečjim poliklonskim anti-RelA (1: 75), mišjim monoklonskim anti-MYH11 (1: 50) ili zečjim poliklonskim anti-TWEAK (1: 100) (Santa Cruz Biotechnology) u trajanju od 1 sata, nakon čega slijedi putem 1 h FITC sekundarnog antitijela (1: 200, Sigma). Nuklei su suprotstavljeni propidijevim jodidom. Poklopi su postavljeni na staklene mikroskopske tobogane prije fluorescentne detekcije.

TNAP aktivnost

h-VSMC (60000 stanica / jažici, ploče sa šest jažica) izgladnjeli su preko noći u 1% DMEM-u nadopunjenom FBS-om prije 7-dnevne izloženosti 1, 5 ml 1% -tnog DMEM-a sa dodatkom FBS koji sadrži ili ne 3 mmol / l Pi i / ili TWEAK. Sve u svakih 2 dana dodano je 750 μl svježeg medija. Aktivnost TNAP-a mjerena je pNPP fosfataznim testnim testom (BioAssay Systems, Hayward, CA, SAD) kao što je prethodno opisano. 60

Gelimografija

H-VSMC su uzgojeni kao za TNAP aktivnost. Nakon 7 dana, h-VSMC supernatanti su centrifugirani da se uklone krhotine i razrijedeni su za dva za procjenu MMP2 aktivnosti. Uzorci su koncentrirani 10 puta sa 10-kDa mikrokonusom (Millipore) za detekciju MMP9 aktivnosti. MMP aktivnost procijenjena je zimogramom želatinaze u gelu (Zymogran gelovi, Life Technologies, Foster City, CA, SAD) kao što je prethodno opisano. 17

Statistička analiza

Rezultati predstavljaju najmanje tri neovisna eksperimenta izvedena u triplikatima koristeći stanice izolirane od različitih davatelja. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM Razlike između skupina procijenjene su korištenjem jednosmjerne ANOVA s Tukeyevim post-hoc testovima pomoću Prism softvera (Graphpad, Verzija 5.0 GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SAD). Za parove parametara podaci su analizirani neparametarskim Mann-Whitney testom. P- vrijednost <0, 05 smatrana je statistički značajnom.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunske brojke

Glosar

BMP2

koštani morfogenetski protein 2

CKD

kronična bolest bubrega

Fn14

molekula inducirana faktorom rasta fibroblasta 14

H-VSMC

ćelija glatkih mišića čovjeka

MAPK

mitogen-aktivirana protein kinaza

MMP

matriks metaloproteinaza

PPI

pirofosfat

T2DM

dijabetes melitus tipa 2

TNAP

tkivna nespecifična alkalna fosfataza

sTWEAK

topljivi TWEAK

ŠTIPANJE

TNF sličan induktor apoptoze

VC

vaskularna kalcifikacija

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)