Uregulacija mir-665 potiče apoptozu i kolitis u upalnoj bolesti crijeva potiskivanjem komponenata stresa endoplazmatskog retikuluma xbp1 i ormdl3 | stanična smrt i bolest

Uregulacija mir-665 potiče apoptozu i kolitis u upalnoj bolesti crijeva potiskivanjem komponenata stresa endoplazmatskog retikuluma xbp1 i ormdl3 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Upalne bolesti crijeva
  • miRNAs
  • Signalizacija stresa

Sažetak

MikroRNA su kritični post-transkripcijski regulatori ekspresije gena i ključni su posrednici patofiziologije upalne bolesti crijeva (IBD). Ova studija ima za cilj proučiti ulogu miR-665 u progresiji IBD-a. PCR analizama u stvarnom vremenu korištena je za određivanje ekspresije miR-665 u 89 svježe izoliranih IBD uzoraka i dekstran sulfat natrija (DSS) induciranih tkiva sluznice debelog crijeva. Uloga miR-665 u izazivanju apoptoze i kolitisa ispitana je obojenjem u Dodatku V, TUNEL (terminalni deoksinukleotidil-transferaza dUTP dick-a), formiranjem kolonije in vitro i modelom kolita izazvanog DSS in vivo. Nadalje, provedena je izvješćivanje luciferaze, analiza Western blot-a i imunoprecipitacija mikroribonukleoproteina kako bi se utvrdilo da miR-665 direktno potiskuje XBP1 (X-box-vezujući protein-1) i ORMDL3 ekspresiju. Ovdje su naši rezultati otkrili da je miR-665 bio značajno reguliran u aktivnom kolitisu. Studije o funkciji i gubitku funkcije pokazale su da ektopična ekspresija miR-665 potiče apoptozu pod različitim upalnim podražajima. Važno je da se promovira primjena miR-665 oponašajući, dok je ubrizgavanje antagomiR-665 in vivo značajno oslabilo kolitis izazvan DSS. Mehanički smo pokazali da miR-665 inducira apoptozu inhibiranjem XBP1 i ORMDL3. Uzeti zajedno, naša otkrića otkrivaju novi regulatorni mehanizam za signalizaciju ER stresa i sugeriraju da bi miR-665 mogao biti potencijalna meta u terapiji IBD.

Glavni

Upalna bolest crijeva (IBD) je složena bolest koju karakteriziraju kronična ili ponavljajuća upala u gastrointestinalnom traktu. Glavne vrste IBD su ulcerozni kolitis (UC) i Crohnova bolest (CD). Iako je IBD rijetko fatalan sam po sebi, zbog kronične upale često nije izlječiv i može povećati rizik od kolorektalnog karcinoma. Nedavni napredak u razumijevanju patobiologije IBD pokazao je da genetski utemeljene interakcije između poremećaja okoline i / ili poremećaja epitela uzrokuju trajnu aktivaciju urođenih i adaptivnih imunoloških odgovora. 1 Na primjer, nedavne studije pružile su valjane dokaze koji povezuju stres endoplazmatskog retikuluma (ER) s patogenezom IBD-a. 2

ER stres je stanični proces potaknut raznim stanjima koja remete gutanje proteina u ER. Da bi se očistili neprimećeni proteini, neotvoreni protein proteina (UPR) obnavlja ER homeostazu. X-box-vezujući protein-1 (XBP1), snažni induktor podskupine UPR ciljnih gena, potreban je za konstitutivno održavanje funkcije ER u svim staničnim tipovima, a delecija XBP1 u stanicama epitela crijeva (IEC) rezultira u spontani enteritis. 3, 4 Nadalje, protein ORMDL3 nalazi se prvenstveno u ER i regulira unos Ca2 + iz citosola i signalizacije Ca2 + posredovanih s ER. 5, 6 Nedavno su studije vezane za genom identificirale ORMDL3 kao još jedan genetski faktor rizika od CD-a i UC-a. 7 Zabilježeno je da gubitak ekspresije XBP1 ili ORMDL3 potiče kolitis i povećava preosjetljivost na apoptozu izazvanu citokinima putem signalizacije c-Jun N-terminalne kinaze (JNK). 2, 3, 8 S obzirom na njihovu kritičnu ulogu u ER stresu i patogenezi IBD-a, bolje razumijevanje regulacije XBP1 i ORMDL3 moglo bi pružiti nove tragove za prognozu i terapiju IBD-a.

Zahvaljujući svojoj ulozi istodobnog suzbijanja različitih ciljnih gena interakcijom s njihovim 3'-UTR elementima mRNA, mikroRNA (miRNA) je uključena u razvoj i razvoj IBD-a. 9, 10, 11 Napominjemo kako nedavna istraživanja sugeriraju da miRNA reguliraju ER stres i izazivaju apoptozu. 12, 13 Na primjer, miR-15b-5p je potisnuo UPR signalizaciju suzbijanjem Rab1A i ubrzanom apoptozom u humanom hepatocelularnom karcinomu. 14 Međutim, doprinosi li progresija IBD-a izmjena stresa posredovana miRNA-om još uvijek nije poznato.

Značajno je da je nedavna studija koja je uspoređivala promjene ekspresije miRNA utvrdila da je miR-665 značajno reguliran u biopsiji sluznice debelog crijeva; Međutim, njegova uloga ostaje nejasna. Ovdje smo, koristeći algoritam TargetScan, otkrili da su i XBP1 i ORMDL3 teoretski ciljni geni miR-665. Nadalje, pokazali smo da miR-665 reducira ekspresiju XBP1 i ORMDL3 izravnim ciljanjem na njihove 3'-UTR, što rezultira aktiviranjem JNK. Povišenost miR-665 potiče apoptozu i koksitis izazvan dekstran sulfat natrijom (DSS) i in vivo i in vitro , dok inhibicija miR-665 izaziva suprotne efekte. Uzeto zajedno, ovi rezultati sugeriraju da miR-665 ima važnu ulogu u regulaciji ER-stresa i može predstavljati terapijsku metu za KVB.

Rezultati

miR-665 je značajno ureguliran u upalnoj sluznici bolesnika s IBD i DSS-induciranim kolitisom u miševa

MiRNA se pojavljuju kao važni regulatori u patogenezi IBD. Analizom javno objavljenog profila ekspresije miRNA (NCBI / GEO / GSE48957; n = 27, uključujući 10 normalnih kontrola i 17 UC uzoraka) 15, otkrili smo da su razine miR-665 ostale normalne biopsije sluznice debelog crijeva, ali postale su oko četverostruko povišene u bolesnici s UC (slika 1a). Potom smo potvrdili ekspresiju miR-665 u tkivima IBD koristeći PCR u stvarnom vremenu. Kao što se očekivalo, ekspresija miR-665 se značajno povećala, s ~ 4-16 puta povećanjem regulacije u CD-u (neaktivan CD, n = 21; aktivni CD, n = 29) i UC (neaktivan UC, n = 16; aktivni UC, n = 23) podskupina u usporedbi s normalnim kontrolnim skupinama, a dalje povišena u bolesnika s aktivnim kolitisom (slika 1b). Štoviše, miR-665 ekspresija je također povećana ~ -6 puta u sluznici tkiva debelog crijeva izazvanih DSS-om. Stoga ovi rezultati sugeriraju da reguliranje miR-665 može doprinijeti napredovanju IBD-a.

Image

miR-665 je izrazito pojačan u upalnoj sluznici bolesnika s kolitisom izazvanim IBD i DSS. ( a ) Razine miR-665 ostale su niske u normalnim biopsijama sluznice debelog crijeva, ali postale su znatno veće u bolesnika s UC procjenom objavljenom mikroraspadnicom (NCBI / GEO / GSE48957; n = 27, uključujući 10 normalnih kontrola, 17 UC uzoraka). P <0, 001. ( b ) PCR analiza u realnom vremenu ekspresije miR-665 u 50 CD-a (neaktivni CD, n = 21; aktivni CD, n = 29) i 39 UC (neaktivni UC, n = 16; aktivni UC, n = 23) uzoraka u usporedbi s normalnim kontrolama. Razina transkripta normalizirana je na U6 izraz. Linije označavaju srednje vrijednosti ± SD ** P <0, 05, *** P <0, 001, dvoredni Studentov t- test. ( c ) PCR analiza u realnom vremenu ekspresije miR-665 kod miševa i kolitisa izazvanih DSS-om. Razina transkripta normalizirana je na U6 izraz. Linije označavaju središte ± SDTwo-tailed Student's t -test

Slika pune veličine

miR-665 senzitivira in vitro induciranu apoptozu izazvanu upalom

Budući da IBD karakterizira difuzna upala sluznice i stanična apoptoza i u CD i UC, nagađali smo da bi miR-665 mogao imati ulogu u apoptozi. Prvo smo egzogeno prekomjerno izrazili miR-665 mimičkom transfekcijom miR-665 (dopunska slika 1). Zaista, testovi obojenja u aneksinu V i TUNEL (terminalni deoksinenukleotidil-transferaza dUTP-a) pokazuju da ektopična ekspresija miR-665 povećava apoptotičku stopu HT-29 i Caco-2 stanicama preosjetljivosti na kemoagent DSS (slike 2a i b ). Nadalje, učinak miR-665 na promicanje apoptoze potvrđen je ispitivanjem profila cijepanja propaspaze-3 i poli (ADP-riboze) polimeraze (PARP) u stanicama HT-29 i Caco-2. Kao što je prikazano na slici 2c, cijepanje i kaspaze-3 i PARP je povećano u stanicama miR-665-prekomjerne ekspresije tretiranim s DSS. Važno je da je ispitivanje formiranja kolonije pokazalo da prekomjerna ekspresija miR-665 izaziva apoptozu stanica HT-29 u prisutnosti DSS, faktora nekroze tumora- α (TNF- a ) i lipopolisaharida (LPS) u usporedbi s kontrolama (Slika 2d).

Image

miR-665 senzitivira in vitro induciranu apoptozu izazvanu upalom . ( a ) Bojenje aneksina V-fluorescein izotiocijanat (FITC) / propidium jodid (PI) naznačenih stanica tretirano s 2% DSS 24 h. ( b ) Reprezentativne mikrografije (lijevo) i kvantifikacije (desno) TUNEL-pozitivnih stanica nakon 24 sata 2% DSS tretmana. ( c ) zapadnja mrlja cijepljene ekspresije kaspaze-3 i PARP ekspresije. α -Tubulin korišten je kao kontrola opterećenja. ( d ) Kvantifikacija kolonija formiranih u miR-665 transficiranim stanicama i kontrola u prisutnosti 2% DSS, TNF- a (20 ng / ml) i LPS (1 μg / ml). Stupci pogrešaka predstavljaju sredstvo ± SD za tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05

Slika pune veličine

Suprotno tome, uloga miR-665 u IBD-u je dodatno ispitana endogenim prigušivanjem miR-665 transfekcijom antagomiR-665 (dopunska slika 1). Otkrili smo da prigušivanje miR-665 smanjuje apoptotičku stopu HT-29 i Caco-2 stanica pod DSS tretmanom (slike 3a i b). Dosljedno, cijepanja i kaspaze-3 i PARP suzbijena su u miR-665-utišanim stanicama tretiranim DSS-om (slika 3c). Štoviše, broj kolonija formiranih od miR-665-tih tih stanica bio je značajno veći u usporedbi s kontrolama nakon tretiranja s DSS, TNF- a i LPS (slika 3d). Uzeto zajedno, naši rezultati pokazuju da ugulacija miR-665 potiče in vitro induciranu apoptozu uzrokovanu upalom.

Image

Šutnja miR-665 štiti od smrti stanica u vit ro. ( a ) Stanice su 24 sata tretirane s DSS-om i obojene s Annexin V-fluoresceinskim izotiocijanatom (FITC) / PI. ( b ) Tiho miR-665 smanjuje broj TUNEL-pozitivnih stanica nakon 24 sata liječenja DSS-om. ( c ) zapadnja mrlja cijepljene ekspresije kaspaze-3 i PARP ekspresije. α -Tubulin korišten je kao kontrola opterećenja. ( d ) Kvantifikacija staničnih kolonija formiranih u stanicama transficiranim antagomiR-665 i kontrola u prisutnosti DSS, TNF- a (20 ng / ml) i LPS (1 µg / ml). Stupci pogrešaka predstavljaju sredstvo ± SD za tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05

Slika pune veličine

Antagoniziranje miR-665 in vivo smanjuje kolitis izazvan DSS-om

Zatim smo ispitali promotivni učinak miR-665 na IBD in vivo , te procijenili može li antagoniziranje miR-665 oštetiti kolitis izazvan DSS-om. Miševima su intraperitonealno ubrizgavani miR-665 mimik, antagomiR-665 ili kontrolirani tri puta tjedno u trajanju od 2 tjedna. Tjedan dana nakon injekcije, miševi su podvrgnuti kolitisu izazvanom DSS 10 dana. Najveći gubitak tjelesne težine primijetili smo kod miševa ubrizganih miR-665 mimikom, dok je ubrizgavanje antagomiR-665 značajno inhibiralo gubitak tjelesne težine izazvan DSS (slika 4a). Nadalje, miševi ubrizgani miR-665 imali su kraće dužine debelog crijeva, gubitak strukture kripti, ulceracija, infiltracija upalnih stanica i viši indeks apoptoze u usporedbi s kontrolama (Slike 4b-e). Važno je da inhibicija miR-665 snažno oslabi skraćenje debelog crijeva, kolitis i staničnu smrt in vivo (slike 4b-e). Ovi rezultati sugeriraju da miR-665 potiče kolitis izazvan DSS-om i da antagoniziranje miR-665 spašava stanice od tih učinaka.

Image

Antagonizirajuće miR-665 in vivo inhibira DSS-inducirani kolitis . ( a ) Promjene tjelesne težine prikazane su kao postoci od osnovne vrijednosti i predstavljaju ± SEM, n = 8. ( b ) Deset dana nakon liječenja DSS-om ispitano je tkivo debelog crijeva. ( c ) Histologija sluznice ispitana je bojom H&E. ( d ) Ocjena ozbiljnosti kolitisa u svakoj skupini. ( e ) Apoptotički indeks (desno) određen je korištenjem postotka pozitivnih TUNEL stanica (lijevo). Stupci pogrešaka predstavljaju sredstvo ± SD za tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05

Slika pune veličine

miR-665 cilja komponente ER stres XBP1 i ORMDL3

Nedavni napredak pokazao je da je put stresa ER primitivni stanični put koji održava staničnu održivost i homeostazu debelog crijeva. Zanimljivo je da smo pomoću javno dostupnog algoritma TargetScan otkrili da temeljne komponente UPR signalnog puta, XBP1 i ORMDL3 , mogu biti potencijalni ciljevi miR-665 (Slika 5a). Western blot-analiza otkrila je da prekomjerna ekspresija miR-665 značajno potiskuje nivo ekspresije XPB1 i ORMDL3, ali inhibicija miR-665 povećava njihovu ekspresiju (Slika 5b). U međuvremenu, otkrili smo da je akumulacija XBP1 i ORMDL3 u staničnoj ER znatno smanjena prekomjernom ekspresijom miR-665, ali povećana njegovom inhibicijom (Slika 5c). Međutim, PCR analiza u stvarnom vremenu otkrila je da se razina mRNA XBP1 i ORMDL3 nisu značajno promijenile nakon promjene miR-665 (dopunska slika 2), sugerirajući da miR-665 inhibira ekspresiju XBP1 i ORMDL3 izazivajući potiskivanje prevođenja.

Image

miR-665 cilja komponente ER stres XBP1 i ORMDL3. ( a ) Predviđeni ciljni niz miR-665 u 3'- UTRs XBP1 i ORMDL3 . Ukazano je mutirano miR-665 (miR-665-mutant) koji sadrži četiri izmijenjena nukleotida u sekvenciji miR-665 sjemena. ( b ) zapadnjačkim mrljama XBP1, ORMDL3, p-JNK i JNK izraza. α -Tubulin je služio kao kontrola opterećenja. ( c ) Western mrlja ekspresije XBP1 i ORMDL3 u ER frakcijama. ERP29 služio je kao marker ER. ( d ) Analiza luciferaze stanica transficiranih s pGL3-XBP1-3'-UTR ili pGL3-ORMDL3-3'-UTR izvještačem sa miR-665 mimikom, antagomiR-665, mimičnom kontrolom, antagomiR kontrolom ili miR-665-mutantom. ( e ) MiRNP IP test koji pokazuje povezanost između miR-665 i XBP1 i ORMDL3 transkripata u HT-29 stanicama. GAPDH je služio kao negativna kontrola. Stupci pogrešaka predstavljaju sredstvo ± SD za tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05

Slika pune veličine

Prethodna studija je otkrila da silazna regulacija XBP1 potiče apoptozu putem JNK aktivacije. 3 Dosljedno, otkrili smo da ektopična ekspresija miR-665 povećava fosforilaciju JNK (p-JNK), dok inhibicija miR-665 smanjuje njegovu fosforilaciju, sugerirajući da miR-665 potiče staničnu apoptozu aktiviranjem JNK (slika 5b). Nadalje, test luciferaze pokazao je da prekomjerna ekspresija miR-665 prigušuje izvještačke aktivnosti vođene 3'-UTR XPB1 i ORMDL3, dok inhibicija miR-665 povećava ove aktivnosti (Slika 5d). Međutim, ektopična ekspresija miR-665 mutanta nije imala represivne učinke na izvještavanje (slika 5d). Štoviše, test imunoprecipitacije mikroribonukleoproteinom (miRNP) pokazao je selektivnu povezanost miR-665 s XBP1 i ORMDL3, ali ne i s GAPDH (slika 5e), što dalje ukazuje na specifične učinke miR-665 na ove ciljeve. Ovi rezultati sugeriraju da miR-665 izravno cilja XBP1 i ORMDL3.

XBP1 i ORMDL3 su funkcionalni efektori za mipto-665-induciranu apoptozu

Zatim smo istražili funkcionalni značaj represije XBP1 i ORMDL3 u apoptozi stanica debelog crijeva. Kao što je prikazano na slikama 6a i b, bilo prešutjivanje XBP1 ili ORMDL3 u stanicama HT-29 i Caco-2 debelog crijeva povećalo je osjetljivost apoptoze izazvane DSS-om. U međuvremenu, stanice koje utiču XBP1 ili ORMDL3 formirale su više kolonija pod DSS tretmanom (Slika 6c). Nadalje, otkrili smo da obnavljanje i ekspresije XBP1 i ORMDL3 ukida stimulativni učinak miR-665 na staničnu apoptozu, kao što ukazuju testovi Priloga V, TUNEL i formiranja kolonija (Slike 6d-f). S druge strane, ili utišavanje XBP1 ili ORMDL3 poticalo je staničnu apoptozu u stanicama inhibiranim miR-665 (dopunska slika 3A-C).

Image

XBP1 i ORMDL3 su funkcionalni efektori za mipto-665-induciranu apoptozu. ( a i b ) Testovi za bojenje iz Dodatka V ( a ) i TUNEL ( b ) koji ukazuju da utišavanje XBP1 ili ORMDL3 potiču staničnu apoptozu stanica debelog crijeva. ( c ) Kvantifikacija kolonija formiranih u stanicama koje utišaju XBP1 ili ORMDL3 u prisutnosti DSS. ( d i e ) Analize bojenja iz Dodatka V ( d ) i TUNEL ( e ), što ukazuje da i XBP1 i ORMDL3 ekspresija ukidaju apoptozu izazvanu miR-665. ( f ) Kvantifikacija kolonija u naznačenim stanicama. Stupci pogrešaka predstavljaju sredstvo ± SD za tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05

Slika pune veličine

Kolektivno, ovi nalazi pokazuju da povišena regulacija miR-665 potiče progresiju IBD inaktivacijom ER stres signala ciljajući XBP1 i ORMDL3, a miR-665 može biti potencijalna terapijska meta.

Rasprava

ER stres uočava se kod mnogih ljudskih bolesti, poput upale, neurodegenerativnih bolesti, metaboličkih bolesti i karcinoma, a utvrđeno je da je UPR, trokraka signalna os, da bi se sačuvala ER homeostaza. 16 Ti stresni odgovori uključeni su u više staničnih procesa, uključujući sintezu proteina, brzinu razgradnje, savijanje i izlučivanje, a zatim potiču migraciju stanica, transformaciju stanica, angiogenezu i staničnu smrt. 17 Za crijevni epitel, ER stres karakteristično inducira primarnim (genetskim) uzrocima povezanim s UPR-om, poput XBP1, ORMDL3 i ARG2, ili sekundarnim (okolišnim) faktorima, uključujući bakterijske toksine (npr. SubAB), mucine ( npr. MUC2), autofagični proteini (npr. ATG16L1) i citokini (npr. TNF- a i interleukin-10), a međusobno djelovanje ovih faktora pokreće kaskade upale koje mogu uzrokovati ili pogoršati homeostatski ER stres. 18 Štoviše, stanična smrt se uvijek aktivira ako se homeostaza ne može ponovno uspostaviti. Dakle, ER stres ima važnu ulogu u razvoju crijevne upale povezane s IBD-om. Iako je postignut veliki napredak u razumijevanju stresa zbog ER-a, regulatorni mehanizam za deregulaciju ER-stresova kod IBD-a i dalje je nejasan. 19 U ovoj smo studiji ustanovili da je miR-665 reguliran u uzorcima IBD-a i značajno potisnuo komponente ER stresa, XBP1 i ORMDL3, što je dovelo do povećanja apoptoze aktiviranjem JNK. Stoga naša studija predstavlja novi mehanizam za modulaciju signalizacije otpornosti na stres, koji bi mogao biti obećavajući terapijski cilj za IBD.

Nedavni napredak pružio je novi uvid u razumijevanje mehanizama ćelijske smrti uzrokovane stresom, a sugerira se da neke miRNA djeluju kao supresori smrti uzrokovane ER stresom. 20 Iako je uzajamno djelovanje miRNA i reakcija na stres potrebno daljnje istraživanje, utvrdili smo da miR-665 cilja na XBP1 i ORMDL3, koji su bili u različitim signalnim putovima reakcija na stres na ER, aktivirao je ekspresiju JNK, što je rezultiralo apoptozom. Doista, izvijestili su da 4-fenil maslačna kiselina (lijek odobren od FDA za poremećaje urea-ciklusa) i ursodeoksiholična kiselina povezana s taurinom in vivo smanjuju ER stres in vivo primjenom mišjih modela pretilosti i dijabetesa tipa 2. 21 Otkrili smo da se nekoliko kliničkih ispitivanja fokusiralo na ulogu TUDCA kod ispitanika koji su dijabetes tipa 1 ili inzulinske rezistencije povezane s inhibitorom proteaze. Zanimljivo je da oralna primjena ublažene TUDCA upale kod modela glodavaca upale tankog crijeva, tada ER stres može biti važan mehanizam u patologiji IBD-a. 22 U našem istraživanju, ekspresija miR-665 je bila značajno regulirana kod eksperimentalnog kolitisa, ali antagoniziranje miR-665 smanjuje ozbiljnost kolitisa. Stoga naši rezultati sugeriraju da miR-665 može predstavljati potencijalnu terapijsku metu za KVB.

Kao što znamo, p53 je glavni vratar stanične apoptoze. Međutim, pronađeno je da ER stres inducira apoptozu uglavnom aktiviranjem JNK signalizacije, što zauzvrat regulira ekspresiju BCL2 i BAX, što dovodi do smrti stanice posredovane mitohondrijom. 23 U ovom kontekstu, ovdje smo koristili p53-mutirane HT-29 i p53-null Caco-2 stanice za ispitivanje promjene ER signala stresa pomoću miR-665. Značajno je da smo miR-665 smanjili ekspresiju XBP1 i ORMDL3 i povećali aktivnost JNK, što je dovelo do povećane osjetljivosti stanične apoptoze na upalne čimbenike. Dakle, ovi nalazi otkrivaju da je osi miR-665 / ER / JNK imala važnu ulogu u progresiji IBD-a neovisno o p53.

Nedavni dokazi pokazali su da je miR-665 pojačan u crijevnom želučanom adenokarcinomu. 24 Izvješćuje se da IBD ima rizik od nastanka karcinoma povezanog s kolitisom (CAC), a povećana učestalost karcinoma iznosi i do 20%. 25 Polytarchou i sur . 26 nedavno su otkrili da je miR-214 prekomjerno ekspresioniran signalnom aktivacijom IL-6 / STAT3 i modulirao ekspresije fosfataze i homologa tenzina (PTEN), PDZ i LIM domene 2 (PDLIM2) i fosforilaciju AKT, što je induciralo aktiviranje nuklearni faktor- κ B (NF- κ B). Štoviše, pokazali su da signalizacija korelira s napredovanjem u kolorektalni karcinom. 26 U međuvremenu, obitelj faktora transkripcije NF- κ B važan je pokretač upale ER stresom, što dovodi do proizvodnje protuupalnog TNF- a i pogoršava staničnu smrt uzrokovanu stresom. 27 Zanimljivo je da su naši rezultati pokazali da ektopična ekspresija miR-665 potiče apoptozu pod različitim upalnim podražajima, poput TNF- a . No, može li miR-665 imati ulogu u razvoju CAC-a uslijed djelovanja upalnih čimbenika ostaje nepoznato. Treba uložiti napore da se ispita ključna uloga miR-665 u napredovanju CAC-a.

Mikrobiota se smatra glavnim uzrokom IBD. 28 Zanimljivo je da je miR-665 izazvan mikrobiotom, što je olakšalo infekciju smanjivanjem Abcc3 u stanicama domaćina, 29 što sugerira da miR-665 može biti važan posrednik u IBD-u izazvanom mikrobiotom. S druge strane, ER stres ima različite posrednike u imunitetu, uključujući proizvodnju protuupalnih citokina. Značajno, analizirajući miR-665 promotorsku regiju pomoću CONSITE programa, pronašli smo nekoliko tipičnih mjesta vezanja za NF-κB, što sugerira da bi miR-665 mogao biti reguliran upalnim NF- κ B signalnim putem. Dakle, miR-665 može potaknuti pozitivnu povratnu informaciju u miR-665 / ER / NF- κ B petlji, što dovodi do kronične upale u gastrointestinalnom traktu. Iako su ove hipoteze odlični pravci koje treba slijediti, ipak je izvan okvira našeg trenutnog projekta i zato ćemo biti istraženi u našim budućim istraživanjima.

Zaključno, naša je studija pokazala da je miR-665 kritični regulator signalizacije ER-stresa i potiče patogenezu kod IBD-a. Razumijevanje precizne uloge miR-665 u patogenezi IBD-a i u reakciji na stres na ER obećava povećanje našeg znanja o biološkoj osnovi razvoja upale i može također olakšati razvoj novih terapijskih strategija protiv KVB-a.

Materijali i metode

Biopsije i etička razmatranja pacijenta

Pacijenti s pacijentima s IBD-om i ne-IBD regrutovani su uz pismeni informirani pristanak za ovo istraživanje u Prvoj pridruženoj bolnici Sveučilišta Sun Yat-sen. I, Bolničko etičko povjerenstvo odobrilo je protokol studije. Upaljeni uzorci biopsije dobiveni su od pacijenata kojima je dijagnosticiran CD ili UC slijedeći standardne kliničke, endoskopske i histološke kriterije, uključujući 29 bolesnika s aktivnim CD-om i 21 pacijenta u remisiji i 23 bolesnika s aktivnim UC-om i 16 bolesnika u remisiji. Težina bolesti procijenjena je prema međunarodnim standardima, kao što je Crohnov indeks aktivnosti bolesti za dijagnozu bolesnika s CD-om i Mayo-ovi rezultati za bolesnike s UC. Kontrolni uzorci dobiveni su od pacijenata koji su podvrgnuti kolonoskopiji kao dio rutinskog programa nadzora polipa bez aktivne gastrointestinalne patologije.

Western blot analiza

Stanice su skupljene u pufer za liziranje stanica (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD) i grijane su 5 min na 100 ° C. Jednake količine denaturiranih uzoraka proteina otopljene su na 10% SDS-poliakrilamidnim gelima i potom su prenesene na membrane polivinilidena difluorida (Roche, Basel, Švicarska). Nakon blokiranja s 5% nemasnog suhog mlijeka u TBS / 0, 05% Tween-20, membrane se inkubiraju sa specifičnim primarnim antitijelom, nakon čega slijedi sekundarno antitijelo konjugirano na hrenov peroksidazu. Proteini su vizualizirani pomoću ECL reagensa (Pierce, Rockford, IL, USA). Antitijela protiv cijepljene kaspaze-3, cijepljeni PARP, XBP1, ORMDL3, ERP29, p-JNK i JNK kupljena su od tvrtke Abcam (Cambridge, MA, USA). Membrane su odstranjene i reponirane anti- α- tubulinskim protutijelom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) kao kontrola opterećenja.

ekstrakcija miRNA i kvantitativni PCR u realnom vremenu

Ukupna miRNA iz svježeg biopsijskog tkiva debelog crijeva izvađena je primjenom mirVana miRNA izolacijskog kompleta (Ambion, Austin, TX, USA) prema uputama proizvođača. Sintetizirali smo cDNA iz 10 ng ukupne RNA koristeći TaqMan miRNA povratnu transkripcijsku garnituru (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD) i kvantificirali smo nivoe ekspresije miR-665 koristeći miRNA-specifičan TaqMan MiRNA test test kit (primijenjeni biosistemi), Ekspresija miRNA definirana je na osnovi Ct, a relativne razine ekspresije izračunate su kao 2 - [(Ct od miR-665) - (Ct od U6)] nakon normalizacije u odnosu na ekspresiju male U6 male nuklearne RNA.

TUNEL test

Apoptotska fragmentacija DNA ispitivana je korištenjem in situ DeadEnd Fluorometric TUNEL sistema za proveru sustava (Promega, Madison, WI, SAD) prema protokolu proizvođača. Ukratko, stanice su stavljene u ploče s ravnim dnom sa 24 jažice i 24 sata tretirane s 2% DSS. Stanice su fiksirane u 4% paraformaldehidu na 4 ° C 30 minuta, permeabilizirane u 0, 1% Triton X-100 i obilježene su fluoresceinom-12-dUTP koristeći terminalnu deoksinukleotidil transferazu. Lokalna zelena fluorescencija apoptotskih stanica iz fluorescein-12-dUTP otkrivena je fluorescentnom mikroskopijom (Axiovert 100 M; Zeiss, Oberkochen, Njemačka).

Model kolitisa izazvan DSS-om

Miševi C57BL / 6 (stari 6–8 tjedana, 18–20 g) kupljeni su u eksperimentalnom centru za životinje na Sveučilištu kineske medicine Guangzhou i smješteni u zapreke 12-satnom ciklusu svijetlo-tamno. Institucionalni odbor za brigu i upotrebu životinja sa Sveučilišta Sun Yat-sen odobrio je sve eksperimentalne postupke. Miševi su nasumično raspoređeni u skupine ( n = 8 po grupi). Miševima u skupinama ubrizgan je intraperitonealno sa 100 µl miR-665 mimik, antagomiR-665 ili negativnom kontrolom (razrijeđen u PBS u 2 mg / ml) tri puta tjedno tijekom 2 tjedna. Nakon 1 tjedna, miševi su podvrgnuti tretmanu s 2% DSS kroz 10 dana. Težine miševa su izračunate. Životinje su tada ubijene, a tkiva debelog crijeva izrezana su i parafirana. Odjeljci tkiva debelog crijeva podvrgnuti su obojenju hematoksilinom i eozinom (H&E) i testom TUNEL. Izmjeren je stupanj upale i ocijenjen kao što je prethodno opisano, 30 i apoptotički indeks mjeren je na temelju postotka stanica pozitivnih na TUNEL.

Analiza luciferaze

Stanice (4 × 10 4 ) su zasađene u tri primjerka u pločicama s 24 jažice i kultivirane 24 sata. Stanice su transficirane sa 100 ng pGL3-XBP1-3'-UTR ili pGL3-ORMDL3-3'-UTR luciferarazni plazmid plus 5 ng pRL-TK Renilla plazmida (Promega) koristeći Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) u skladu s preporuke proizvođača. Signali luciferaze i Renila izmjereni su 36 sati nakon transfekcije pomoću dvostrukog kompleta za ispitivanje Luciferaze (Promega) prema protokolu proizvođača.

miRNP imunoprecipitacija

Stanice su kofeficirane s HA-Agol, zajedno sa 100 nM miR-665, nakon čega je slijedila imunoprecipitacija HA-Ago1 koristeći antitijelo protiv HA. PCR analiza imunoprecipitiranog materijala u stvarnom vremenu korištena je za ispitivanje povezanosti mRNA XBP1 i ORMDL3 s RISC kompleksom.

Statistička analiza

Sve statističke analize provedene su korištenjem statističkog softverskog paketa SPSS verzije 19.0 (SPSS lnc., Chicago, IL, SAD). Podaci su izraženi kao sredstvo ± SD Usporedba između skupina provedena je s neparnim dvorednim Studentovim t- testom. U svim se slučajevima P- vrijednost <0, 05 smatrala statistički značajnim.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)