Uregulacija i nuklearna translokacija testisa grelin štiti diferencirajuću spermatogoniju od ozljede ionizirajućeg zračenja | stanična smrt i bolest

Uregulacija i nuklearna translokacija testisa grelin štiti diferencirajuću spermatogoniju od ozljede ionizirajućeg zračenja | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • Neplodnost

Sažetak

Pravilna kontrola apoptotske signalizacije važna je za održavanje homeostaze testisa nakon ionizirajućeg zračenja (IR). Ovdje smo doveli u pitanje hipotezu da je grelin, pleiotropni modulator, potencijalno uključen u ozljedu klicnih stanica izazvanih IR-om. Niža izloženost tijela 2 Gy IR izazvala je značajan porast ekspresije grelina u jezgri diferencirajuće spermatogonije u definiranim fazama, s oštećenjem Leydigovih stanica (LC) koje eksprimiraju grelin. Neočekivano, inhibicija puta grelina intraperitonealnim ubrizgavanjem specifičnog GHS-Rl α antagonista pojačalo je eliminaciju spermatogonije apoptozom tijekom ranog oporavka nakon IR-a, a nakon toga rezultiralo smanjenom plodnošću muškaraca, što sugerira da su anti-apoptotički efekti evociranog grelina, iako prolazne duž ozljede testisa, imaju snažan utjecaj na oporavak nakon ozljede. Pored toga, inhibicija grehlin signalizacije rezultirala je značajnim povećanjem razine intratestikularnog testosterona (T) na kraju 21 dana nakon IR, što bi trebalo potaknuti spermatogenski oporavak od preživjele spermatogonije u određenoj mjeri tijekom kasne faze. Nadalje smo pokazali da regulacija i nuklearni promet grelina, detaljno reguliran IR-om izazvanim antioksidacijskim sustavom u spermatogoniji, može djelovati preko mehanizma ovisnog o p53. Ispiranje grelin ekspresije IR stresom, regulacija ekspresije grelina IR-induciranim oksidativnim stresom i interakcija između p53 i grelin signalizacije tijekom IR ozljede potvrđeni su u uzgojenoj spermatogoniji. Dakle, naši rezultati predstavljaju prvi dokaz u prilog radioprotektivnoj ulozi grelina u diferencirajućoj spermatogoniji. Čini se da je oštro, osjetljivo reguliranje lokalno proizvedenog ghrelina fino podešen mehanizam koji modulira ravnotežu između homeostaze testisa i rane IR ozljede.

Glavni

Spermatogeneza, fino podešen proces, vrlo je osjetljiv na endogeni i egzogeni stres. 1, 2, 3 Terapije protiv raka poput zračenja često dovode do privremenog poremećaja ili potpunog zaustavljanja spermatogeneze. 4 U većim slučajevima štetni učinci ionizirajućeg zračenja (biološko tkivo) na biološko tkivo posreduju neizravnim interakcijama, što povećava proizvodnju hidroksilnih radikala (• OH) radiolizom H20, nakon čega slijedi nenormalno povišenje citotoksičnih reaktivnih vrsta kisika ( ROS) i oksidativna oštećenja. 5, 6 Potonji rezultira blokom staničnog ciklusa, nakon čega slijedi apoptoza ukoliko je oštećenje ozbiljno. Apoptotična smrt odabranih klijavih stanica (GC) nakon ozračivanja pomaže u održavanju pravilnog odnosa GC-a prema sertolijskim stanicama (SC). 7 Iako je p53 neophodan za smrt izazvanu GC zračenjem, relevantni biokemijski događaji nakon aktivacije p53 u testisima nisu dobro okarakterizirani. S druge strane, IR različito inducira apoptozu GC-a, pri čemu je najosjetljivija aktivno podijeljena spermatogonija. 9 U tu svrhu, strogo održavanje genomske stabilnosti i sprječavanje pretjeranog oštećenja spermatogonije su neophodni za uspješan ishod mejoze kako bi se osigurala vjernost dovoljna za ispravnu nasljednost nakon zračenja.

Ghrelin je izvorno identificiran kao endogeni ligand receptora za sekretagog hormona rasta (GH) (GHS-R). Od tada, sve veći broj dokaza pokazuje potencijalnu uključenost u mušku reprodukciju. 10 Ghrelin i njegov funkcionalni receptor izraženi su u testisima štakora i ljudi. 11 Ghrelin je uglavnom primijećen u intersticijskim Leydigovim stanicama (LC). 12 Funkcionalno, grelin može in vitro inhibirati lučenje ljudskog CG- i cAMP-stimulirane sekrecije testosterona (T). 13 Pored toga, pokazali smo da deregulirana ekspresija grelina doprinosi patogenezi muške neplodnosti izazvane manjkom leptina. 14. Kolektivno, grelin može poslužiti kao pleiotropni modulator muške reprodukcije. 15

Nedavni radovi ukazuju na izravno sudjelovanje grelina u apoptozi GC-a. Na primjer, primjena grelina značajno je suzbila proliferacijski peptidni PCNA u spermatogoniji kao i u spermatocitima. Inhibicija grelin signalizacije smanjuje GC apoptozu i time rezultira poboljšanom proizvodnjom sperme u ob / ob miševima. 14 Pored toga, grelin može inhibirati ekspresiju gena koji kodira faktor matičnih stanica ( Scf ), koji djeluje kao glavni faktor preživljavanja parakrina tijekom ozljede GC. 17 Ipak, uloga i temeljni mehanizam lokalnog grelina u apoptozi GC-a testisa pod određenim patološkim uvjetima ostaje neizlječiv. Stoga je ovaj rad pokušao istražiti moguću uključenost grelina testisa u ozljedu testisa izazvanu IR-om.

Rezultati

Izražavanje grebena testisa povezano je s pojačanom apoptozom nakon IR ozljede

Ekspresija grelina u testisima prvo je istražena na razini mRNA i proteina. Početne kvantitativne analize lančane reakcije transkripcije i polimeraze (qRT-PCR) pokazale su jasno povišenje razine grelina kao reakcije na testis IR, bez razlike između dvije vremenske točke nakon tretmana (slika 1a). Taj je izraz potvrđen na translacijskoj razini (Slika 1b). Kod kontrolnih miševa imunoreaktivnost grelina uglavnom je otkrivena u citoplazmi LC-a, što je IR znatno otklonilo. Suprotno tome, imunoreaktivnost grelina bila je uglavnom lokalizirana u nuklearnom dijelu u vanjskom sloju sjemenih tubula nakon IR-a (slika 1c). Čini se da je ekspresija grelina izazvana IR-om ograničena na spermatogoniju kao što je prikazano u većem povećanju (umetanje na slici 1c). Konkretno, grelin se prvi put pojavio u fazi II-IV, održavao je stabilnu razinu na stupnju V-VI, a dostigao je najvišu razinu u fazi VII-VIII (dopunska slika S1). Subcelularna lokalizacija IR-induciranog grelina potvrđena je imuno-blotirajućom analizom citoplazmatskim markerom Gapdh i histonom H1 nuklearnim markerima u ekstraktima izolirane spermatogonije (slika 1d i dodatna slika S2). Budući da je ubijanje muških GC zračenjem ranije pripisano apoptozi 7 (također smo potvrdili da povećana apoptoza, abecedna proliferacija stanica, doprinosi gubitku stanica u ozračenim testisima (dopunske slike S3 a-c)) i apoptozi mišjih GC-a nakon što IR testisa dosegne maksimalnu razinu oko 16 h (kako je procijenjeno apoptotičkim indeksom, slika 1e), utvrdili smo da li su GC-i koji izražavaju nuklearni grelin doživljavali apoptozu primjenom dvostruke imunofluorescentne analize u ovom trenutku. TUNEL-pozitivne stanice (prazne strelice na slici 1f), za koje je potvrđeno da su spermatogonije (suplementarna slika S3d), pojavile su se u vanjskom sloju sjemenišnih tubula nakon tretmana 16 h. Suprotno tome, nijedan apoptotički GC nije nađen pozitivan na imunološko obojenje grelinom (strelice na slici 1f). Ovi rezultati kolektivno ukazuju na potencijalnu uključenost grelina u povredu testisa izazvanu IR-om.

Image

IR tretman u dozi od 2 Gy izazvao je značajno povećanje ekspresije grebena u testisu. ( a ) Relativna razina ekspresije grebena testisa u različitim vremenskim točkama nakon IR tretmana praćena je kvantitativnim RT-PCR (qRT-PCR) ( n = 3). ( b ) Western blot analiza analize proteina grelina u dvije vremenske točke nakon IR tretmana. Actin je služio kao kontrola opterećenja. ( c ) Presjeci testisa iz Bouinovog fiksiranog parafinskog testisa imunostanirani su na ghrelin koristeći zečje anti-grelin poliklonalno antitijelo. Imunoreaktivni grelin pojavio se kao crvenkasto-smeđi talog i uglavnom je otkriven u Leydigovim stanicama (LC) kontrolnih testisa i u spermatogoniji (Spg) ozračenih testisa. Odjeljci imuno obojeni sa pretapsorbiranim serumom (NC, negativna kontrola) nisu pokazali pozitivne signale, pokazujući specifičnost ovog antitijela. Veća uvećanja bazalnog sloja spermatogonije u tubulama prikazana su kao insekti. Spc, spermatociti; Esd, izduženi / izduženi spermatid. Bar = 20 μ m. ( d ) Nakon izlaganja, Spg su podvrgnuti citoplazmatskoj i nuklearnoj analizi frakcioniranja nakon čega su slijedile imunobloting analize kako je opisano u Materijalima i postupcima. ( e ) Apoptotički indeks određen je postotkom sjemenog tubula s više od tri TUNEL-pozitivne stanice. Za pozitivnost TUNEL-a zabilježeno je više od 200 tubula. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM iz najmanje tri neovisna pokusa. ( f ) Kombinirani TUNEL (prazne strelice) i dvostruko imunofluorescentno označavanje ukazuje na ne-apoptotičke klice stanice koje izražavaju grelin (strelice) na kraju 16 sati nakon IR tretmana. Nuklearne su demonstrirane pomoću DAPI bojanja. Bar = 20 μ m

Slika pune veličine

Inhibicija grehlin signalizacije pojačava IR-inducirano oštećenje mitisa testisa

Naknadne analize bile su usmjerene na karakterizaciju uloge endogene signale grelina u oštećenju GC-a izazvanog IR-om. Miševe smo tretirali s [D-Lys-3] -GHRP-6 (D-GHRP) (slika 2a), specifičnim antagonistom GHS-R1 α , za koje se pokazalo da učinkovito inhibira učinke grelina u tijelu. 14 Prvo smo pokazali da samo liječenje D-GHRP-om nije imalo očitu toksičnost za razvoj GC-a (dopunska slika S4). Nakon tretmana D-GHRP-om, vrlo je malo GC-a unutar sjemeničnih tubula pronađeno pozitivno na nuklearno bojenje nakon tretmana 16 h, što sugerira da poremećaj interakcije ghrelina i njegovog receptora može učinkovito blokirati translokaciju ghrelina kao odgovor na uvredu IR ( Slika 2b). Naknadne kvantitativne analize TUNEL otkrile su da inhibicija grehlin signalizacije značajno pospješuje IR-induciranu apoptozu GC-a nakon tretmana 16 h, a nije otkrivena razlika 21 dan nakon tretmana (Slika 2c). Kao što je prikazano na slikama 2d-f, relativni postoci primarnih spermatocita (4C) u skupinama tretiranim nosačem i D-GHRP u post-IR 16 h obje su značajno povećane u usporedbi s onim u kontrolnih miševa koji su tretirani samo D-GHRP ( P <0, 05). Suprotno tome, primijećeno je samo značajno povećanje relativnih postotaka spermatogonije (2C) u skupinama liječenim D-GHRP u periodu nakon IR-a 16 h. Što se tiče 21 dana nakon IR-a, relativni postoci 4C i spermatida (1C) značajno su smanjeni u skupinama tretiranim nosačem + IR ili D-GHRP + IR, a značajno niža vrijednost 1C otkrivena je u D-GHRP + IR grupe. Učinak liječenja D-GHRP na gubitak GC izazvanih IR-om također je morfološki potvrđen u obojenju hematoksilinom i eozinom (dodatna slika S5). Ovi rezultati pokazuju da genetska oštećenja izazvana IR-om vjerojatno potječu od spermatogonije i da se ne mogu učinkovito popraviti u nedostatku signala grelina, a nakon toga se manifestiraju u kasnom stadiju spermatogeneze. Da bismo dalje utvrdili u kojoj je fazi blokirana diferencijacija spermatogonije, izvršili smo qRT-PCR analizu na testisnoj RNA iz D-GHRP ili miševima prethodno tretiranim kontrolnim nosačima na post-IR 16 h koristeći specifične primere za miša Zbtb16 i Pou5f1 (nediferencirana spermatogonija), za miša Kit i Sohlh2 (različita spermatogonija) i za mišji Ldh-c4 (preleptotenski spermatociti). 18, 19, 20 Svi ispitivani stanični markeri pokazali su se da se konstantno izražavaju u post-IR 16 h, s tim da se značajno smanjenje otkriva samo u diferencirajućoj spermatogoniji D-GHRP-tretiranih skupina (Slika 2g). Ovi podaci sugeriraju da se zaštitni učinak endogenog grelina protiv infarkta testisa uglavnom dogodio kod diferencirajuće spermatogonije. Dostupni podaci postavili su nas da se pitamo jesu li preživjeli spermatozoidi sposobni za osemenjavanje jajašca, čime zadržavaju svoju reproduktivnu sposobnost. Proveli smo eksperimente parenja na kraju 45 dana nakon IR tretmana jer se smatra da je spermatogeneza u potpunosti obnovljena oko tog vremenskog razdoblja nakon zračenja malim dozama. 21 Općenito, potencijal plodnosti je značajno obnovljen kod miševa koji su prethodno bili podvrgnuti kontroli. Suprotno tome, inhibicija grelinove signalizacije rezultirala je dramatičnim padom brzine impregnacije (slika 2h). Ovi rezultati uvjerljivo potvrđuju da je aktiviranje grelina signalizacije u spermatogoniji neophodan obrambeni mehanizam protiv infarkta testisa.

Image

Prolazni anti-apoptotički učinak endogenog grelina na diferencijaciju spermatogonije potreban je za njihov rani oporavak od testisa IR testisa (2 Gy). ( a ) Shematski prikaz eksperimentalnog postupka korištenog u trenutnoj studiji. ( b ) Ukidanje IR-inducirane nuklearne translokacije grelinom intraperitonealnim ubrizgavanjem specifičnog GHS-R1 α antagonista primijećeno je na kraju 16 sati nakon IR tretmana imunohistokemijskim bojenjem. LC, Leydigova stanica; Spg, spermatogonija. Bar = 20 μ m. ( c ) Kvantifikacija apoptotičkog indeksa u ctrl nosaču ili D-GHRP grupama prethodno obrađenim, kako je gore opisano, u različitim vremenskim točkama nakon IR stresa. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM iz najmanje tri neovisna pokusa. ( d - f ) Relativna promjena postotka zametnih stanica 16 h / 21 dan nakon IR ispitano je protočnom citometrijom. ( g ) Štetni učinci inhibicije grelina na diferencijaciju spermatogena na post-IR 16 h procijenjeni su qRT-PCR analizama koristeći posebne primere za Zbtb16 i Pou5f1 (nediferencirana spermatogonija), za Kit i Sohlh2 (diferencirajuća spermatogonija) i za Ldh- c4 (preleptotenski spermatociti). Gapdh je služio kao unutarnja kontrola. Rezultati prikazani kao prosjek ± SEM tri neovisna pokusa. * P <0, 05. ( h ) Ispitivanja plodnosti u ctrl nosaču ili miševima prethodno tretiranim D-GHRP provedena su kako je opisano u Materijalima i postupcima.

Slika pune veličine

Učinci inhibicije grelina na hormone vezane uz spermatogenezu nakon ozljede IR-a

Razine hormona, uključujući T, luteinizirajući hormon (LH) i folikul stimulirajući hormon (FSH), procijenjene su s obzirom na njihove ključne uloge u kontroli spermatogeneze. 22 Unatoč prijavljenom inhibicijskom učinku grelina signalizacijom na steroidogenezi testisa, 13 miševa je održavalo koncentraciju LH, T i FSH prilično konstantnim tijekom prvih 16 sati nakon ozračivanja (Slike 3a-d). Suprotno tome, razina intratestikularnog T ostala je značajno visoka tijekom 21 dana nakon IR-a u obje skupine, s tim da je u ovoj točki najviša razina otkrivena u D-GHRP-skupinama (Slika 3a). Dosljedno, značajan pad LH u plazmi također se može otkriti u obje skupine nakon 21 dana nakon tretmana, s nižom vrijednosti opaženom u D-GHRP grupama (Slika 3c). Štoviše, razina FSH u plazmi u dvije eksperimentalne skupine znatno je povišena nakon 21 dana nakon IR-a, bez razlike između različitih skupina (Slika 3d). Ovi podaci sugeriraju da signalizacija grelina može biti uključena u serološke promjene tijekom kasnog oporavka od IR ozljede testisa.

Image

Učinci suzbijanja grelinova putanja na razinu hormona povezanih sa spermatogenezom nakon IR ozljede testisa (2 Gy). U različitim vremenskim točkama nakon IR tretmana, dobiveni su ekstrakti seruma i testisa iz različitih eksperimentalnih skupina kako je naznačeno, a intratestični testosteron (T) ( a ) i plazma T ( b ), LH ( c ), FSH ( d ) analizirani su kao opisano u Materijalima i postupcima. Rezultati su prosječni ± SEM za pet životinja u skupini. Vjerojatnost P <0, 05 smatrala se statistički značajnom

Slika pune veličine

Regulacija ekspresije grelina testisom oksidativnim stresom testisa kao odgovor na IR ozljedu

IR testici uzrokovani IR testisom, koji je karakteriziran povišenom stvaranjem malondialdehida (MDA) (slika 4a) i pojačanom ekspresijom antioksidanata (slike 4b i c). 23 Dodatak egzogenih antioksidanata (Vit C + Vit E) mogao bi u znatnoj mjeri smanjiti oksidativni stres testisa izazvan IR-om (slike 4a-c). Zanimljivo je da je IR izazvao značajan porast ekspresije grelina nakon post-IR 16 h, dok je opetovano davanje Vit C + Vit E prije ozračivanja značajno ugrozilo ovu regulaciju (Slika 4d). Dosljedno, samo je mali dio nuklearno pozitivnog bojenja uočen kod miševa prethodno tretiranih s Vit C + Vit E nakon IR-a 16 h (slika 4e). Da bismo utvrdili da li oksidacijski sustav ili antioksidacijski sustav regulira ekspresiju grelina tijekom povrede IR-a, ispitali smo ekspresiju grelina nakon zračenja niskim dozama (2 Gy) ili zračenja visokim dozama (5 Gy). Kako se povećala intenzivnost zračenja, značajno povećana koncentracija MDA (dopunska slika S6a), snižavanje vrijednosti glutation-peroksidaze (GPX) (dopunska slika S6b) i ukupna razina superoksid-dismutaze (T-SOD) (dodatna slika S6c) na post-IR 16 h podrazumijevalo je ozbiljno oštećenje testisa. Zračenje visokim dozama dramatično je smanjilo izraženu grelinu u testisima (dopunska slika S6d). Dosljedno, nuklearno bojenje grelinom često uočeno u određenim fazama nakon zračenja niskim dozama jedva je bilo detektirati nakon zračenja visokim dozama (dopunska slika S6e). Da bismo dalje definirali specifičnu antioksidacijsku signalizaciju, koja može regulirati ekspresiju grelina tijekom IR-a, tretirali smo miševe s T-SOD inhibitorom 10 min prije zračenja. Iznenađujuće, inhibicija aktivnosti T-SOD značajno je ukinula IR-induciranu regulaciju (slika 4f) i nuklearnu translokaciju (slika 4 g) testisnog grelina u post-IR 16 h. Modulacija oksidacijske signalizacije na ekspresiju grelina izazvanog IR-om dodatno je potvrđena primjenom imuno-bloting analiza u nuklearnim ekstraktima spermatogonije (Slika 4h). Prema tome, T-SOD aktiviranje izazvano oksidativnim stresom može djelovati na vrh signala grelina tijekom ranog oporavka nakon IR stresa.

Image

Oksidativni stres testisa regulira ekspresiju grelina tijekom IR ozljede (2 Gy). Učinci IR liječenja zajedno s dodatkom antioksidansa na parametre oksidacijskog stresa, uključujući malondialdehid (MDA) ( a ), glutation peroksidazu (GPX) ( b ) i ukupnu superoksid dismutazu (T-SOD) ( c ), određeni su 16 h nakon ozračivanja kao što je opisano u Materijali i metode. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM iz najmanje tri neovisna pokusa. ( d ) Učinci dodataka antioksidanata na razinu ekspresije grelina izazvanih IR-om mjereni su primjenom Western blot-a u post-IR 16 h. Actin je služio kao kontrola opterećenja. ( e ) Učinci dodataka antioksidanata na uzorak ekspresije grelina izazvanog IR-om ocjenjivani su korištenjem imunohistokemije. Spg, spermatogonija. Bar = 20 μ m. ( f ) Učinci liječenja trihidratom natrijeve soli dietilditiokarbaminskom kiselinom (DEDT) na razinu ekspresije grelina izazvanom IR-om izmjereni su primjenom Western blot-a u post-IR 16 h. ( g ) Učinci DEDT tretmana na uzorak ekspresije grelina izazvanog IR-om ocjenjivani su korištenjem imunohistokemije. Bar = 20 μ m. ( h ) Učinci tretmana DEDT, Vit C + E ili D-GHRP na obrazac ekspresije grelina izazvanog IR-om provjereni su u nuklearnim ekstraktima iz uzgojene spermatogonije (Spg) primjenom Western blotiranja na post-IR 16 h. Donje ploče predstavljaju mrlje reprobirane za nuklearni marker, naime hison H1

Slika pune veličine

Uvjet transaktivacije p53 u ekspresiji grelina izazvanog IR

Apoptoza ovisna o P53 činila je najveći dio gubitka diferencirajuće spermatogonije nakon IR. 24 U tom kontekstu, ispitali smo povezanost endogenog grelina i p53 u nuklearnim ekstraktima testisa nakon 16 sati nakon IR-a. Interakciju je moguće otkriti samo uz prisustvo IR stresa (slika 5a). Slično tome, u uzgojenoj spermatogoniji IR stres izazvao je značajnu interakciju između p53 i grelina, što bi se moglo znatno ugroziti tretmanom s Vit C + Vit E, DEDT ili D-GHRP (Slika 5b). Zatim smo tretirali miševe sa specifičnim kemijskim inhibitorom p53 puta prije IR tretmana. Kao što se očekivalo, jedno intraperitonealno (ip) ubrizgavanje PFT α 5 dana prije IR pokusa oslabilo je aktiviranje endogenih staničnih gena odgovornih za p53, uključujući ciklin G , p21 / waf1 / cip1 i mdm2 (dopunska slika S7a), i posljedično smanjilo GC apoptoza na post-IR 16 h (dopunska slika S7b). Dosljedno, nađeno je da je nekoliko spermatogonija u testisima tretiranim PFT α pozitivno na bojenje grelinom (Slika 5c). Inhibicijski učinak PFT α na nuklearnu translokaciju grelina nakon IR stresa potvrđen je korištenjem imunobloting analiza u ekstraktima izolirane spermatogonije (Slika 5d). Nadalje, čini se da inhibicija grelinove signalizacije nema značajnog utjecaja na put induciran p53, što je određeno qRT-PCR analizama koristeći dva gena koji su reagirali na p53 (slika 5e). Ovi rezultati sugeriraju da se translokacija grebena testisa može postići mehanizmom ovisnim o p53.

Image

Zahtjev transaktivacije p53 u IR tretmanu (2 Gy) -inducirana nuklearna translokacija testisnog grelina. ( a ) Pojačanje povezanosti između testisa ghrelin i endogenog p53 kao odgovora na IR tretman pokazalo se primjenom Co-imunoprecipitacije (Co-IP) testa, praćeno analizom Western blottinga 16 sati nakon ozračenja. Lizati testisa (30 μg proteina, bez Co-IP) i Co-IP izvedeni s normalnim kozjim (Gt) IgG poslužili su kao pozitivne i negativne kontrole. ( b ) Učinci tretmana Vit C + E, DEDT ili D-GHRP na interakciju izazvanu IR-om između ghrelina i p53 provjereni su u nuklearnim ekstraktima iz uzgojene spermatogonije (Spg) primjenom Co-IP praćene imunobloting analizama na post-IR 16 h. ( c ) Učinci prethodne obrade PFT α na uzorku ekspresije grelina izazvanog IR-om određeni su korištenjem imunohistokemije 16 h nakon IR-a. LC, Leydigova stanica; Spg, spermatogonija. Bar = 20 μ m. ( d ) Učinci prethodne obrade PFT α na nuklearnu translokaciju grelina izazvanom IR-om provjereni su u nuklearnim ekstraktima iz uzgojene spermatogonije (Spg) primjenom western blotiranja nakon 16 sati nakon IR-a. Donje ploče predstavljaju mrlje reprobirane za nuklearni marker, naime hison H1. ( e ) Učinci inhibicije grelina na aktivnost p53 na IR stresu ocjenjeni su korištenjem qRT-PCR analiza s dvije p53 molekule puta u testisima tretiranim D-GHRP ili ctrl vehikulima. Grupe s različitim natpisnim slovima statistički se razlikuju ( P <0, 05)

Slika pune veličine

Rasprava

U ovom istraživanju, jedan IR je izazvao dramatično povećanje razine ekspresije grelina u obje proučene vremenske točke. Međutim, uregulacija ekspresije grelina bila je samo pozitivno povezana s povišenom apoptozom u post-IR 16 h (slika 1e), što sugerira da se učinak uregulacije grelina na ozljede GC uglavnom događa tijekom vrlo rane faze nakon IR stresa. U korist ove pretpostavke, prethodna ispitivanja pokazala su uključenost egzogenog grelina u akutnu ozljedu drugih tkiva. Intravenska injekcija grelina može ublažiti akutnu ozljedu pluća uzrokovanu sepsom i smrtnost. 25 Slično tome, grelin ima hepatoprotektivni učinak na akutnu ozljedu jetre izazvana ugljikovim tetrakloridom. 26 U tom je kontekstu moguće da pojačana proizvodnja endogenog grelina u ozračenim testisima može poslužiti kao mehanizam za brzo reagiranje.

Jedna od karakterističnih karakteristika u našem istraživanju je dramatično smanjenje ekspresije grelina u LC-u koje se dogodilo odmah nakon IR-a (slika 1c). To je razumljivo jer patološka stanja ozračenih testisa obično suprotno pogoduju statusu LC-a. 27 Međutim, oštećenje ekspresije grelina u LC-u očito nije uzrokovalo mnogo štetnih učinaka na funkciju LC-a tijekom ranog oporavka, jer značajan porast intratekularne razine T može se otkriti tek nakon 21-og dana nakon IR-a, pri čemu se primjećuje veća vrijednost u skupinama pred-tretiranim D-GHRP (slika 3a). Ovo je opažanje u skladu s prethodnim izvješćem da su LC-i otporniji na ozračivanje od zračenja u usporedbi s GC-om. 28 Važnost ovog promatranja dvostruka je: (1) nadalje dokumentira sposobnost grelina da negativno modulira steroidogenezu testisa; (2) po prvi put pokazuje da testis može koristiti reguliranje intratestikularne razine T, koja može nastati uslijed smanjene regulacije ekspresije grelina, kao mehanizam za poticanje samo-oporavka, jer je pokazano da kontinuirano liječenje T-om nakon IR izrazito potaknuo oporavak spermatogeneze. 29

IR učinkovito izaziva smrt GC-a, pri čemu je najosjetljivija aktivno podijeljena spermatogonija; za doze niže od 0, 1 Gy poznato je da oštećuju ove stanice. 9 U našim eksperimentima, ekspresija grelina u spermatogoniji dramatično je povećana nakon liječenja IR-om (slike 1c i d), što sugerira izravnu uključenost ove molekule u lokalnu kontrolu premeiotske homeostaze nakon infarkta IR-a. Naš rezultat lokalizacije nije bio u skladu s ranije prijavljenom prisutnošću grelina u testisima glodavaca, a u kojem je utvrđeno da se grelin izražava u LC-ima. 12 Tri razloga mogu vam pomoći objasniti nepodudarnost izraza. (i) Izražena je ekspresija GHS-R1 α u cjevastom odjeljku testisa. 14 Dakle, teoretski, grelin može izravno sudjelovati u lokalnoj regulaciji GC funkcije. (ii) Preraspodjela proteina u različitim staničnim odjeljcima predstavlja važan način regulacije stanične reakcije na stresna stanja. 30 U tom smislu, trgovina grelinom nakon ozračivanja naglašava njegovo jedinstveno djelovanje kao svojstveni autokrini / parakrini modulator tijekom IR ozljede. (iii) IR-inducirani specifični grelinski signali primijećeni su isključivo u spermatogoniji u definiranim fazama seminifernog epitelijskog ciklusa (u fazama II-VIII). Fiziološko značenje takvog postupnog uzorka ekspresije čeka daljnje istraživanje, premda je primamljivo naglasiti da su se te faze dobro povezale s razvojem spermatogonije. 31 Dakle, grelin može imati određeni učinak na mitozu testisa kao odgovor na IR stres.

Daljnji dokazi o funkcionalnoj ulozi povišene ekspresije grelina pruža njegova sposobnost da izazove zaštitni učinak na diferencijaciju spermatogonije u prisutnosti IR testisa. Inhibicija interakcije između grelina i njegovog receptora korištenjem D-GHRP učinkovito je suzbila nuklearnu translokaciju grelina od post-ozračivanja 16 h nadalje (Slika 2b), ali samo selektivno rezultirala je neregulisanom apoptozom nakon 16-satnog ozračenja (Slika 2c), sugerirajući da se prijelazni zaštitni učinak grelina na GC uglavnom javlja tijekom rane faze oporavka. Naknadne analize FACS-a nadalje su potvrdile da su spermatogonije stanične vrste najosjetljivije na oštećenja izazvana zračenjem (slike 2d-f), što ukazuje na izravnu uzročno-posljedičnu vezu između poremećaja signalizacije grehlinom i premeiotičkog oštećenja izazvanog IR-om. Specifičnost zaštitnih učinaka grelina na testis IR, indirektno pokazuje činjenica da je inhibicija grelinove signalizacije značajno pojačala umanjenje izraza dva markera za razlikovanje spermatogonije, naime Kit i Sohlh2 (slika 2g), što ukazuje da je diferencirajuća spermatogonija vjerojatno su glavna mjesta djelovanja grelina tijekom IR ozljede. Napominjemo da je nakon 45 dana nakon IR-a, kada se spermatogeneza treba potpuno obnoviti, stopa impregnacije za miševe tretirane D-GHRP-om bila još uvijek mnogo manja od one kod miševa tretiranih nosačem (Slika 2h). Stoga zaštitni učinci grelina, iako prolazni duž IC ozljeda testisa, imaju snažan utjecaj na oporavak muške plodnosti nakon ozljede.

Čini se da je ekspresija grebena u testisima kao odgovor na IR izvrsno regulirana. Prvo, razina ekspresije grelina znatno je regulirana odmah nakon dodavanja antioksidansa (Vit C + Vit E; slike 4d, e i h), što sugerira da je ekspresija grelina izazvana IR-om tonzijski modulirana (bilo pozitivno ili negativno) oksidativnim stresom. Doista, deregulirane razine grelina često su povezane s oksidativnim stresom u različitim ljudskim patologijama. 32, 33, 34 Nadalje, egzogeni grelin može imati zaštitne učinke protiv oksidativnog stresa u različitim patološkim uvjetima. 35 Naši nalazi proširuju ovo razumijevanje identificirajući oksidativni stres izazvan IR-om kao moćan poticaj ekspresije grebena testisa. Međutim, čini se da antioksidativni sustav, a ne oksidacijsko oštećenje, sam po sebi ima značajniju ulogu kao sredstvo za uklanjanje grebena testisa tijekom IR ozljede (dopunska slika 6). Ova tvrdnja može također objasniti zašto se ekspresija grelina izazvanog IR-om pojavljuje samo u vrlo ranoj fazi oporavka, jer je antioksidacijski sustav obično ugrožen u kasnijoj fazi oštećenja tubula. 36 Što se tiče enzimskih sastavnih dijelova ovog obrambenog sustava, SOD djeluje kao prvi i brzi korak brze pretvorbe superoksidnog aniona (O2 - .) U vodikov peroksid (H202) kako bi se spriječili visoko štetni hidroksilni radikali. 36 Nedavna istraživanja otkrivaju da SOD igra važnu ulogu protiv oksidativnih oštećenja testisa u spermatogoniji. 23 U našem istraživanju, Čini se da je SOD specifičan antioksidacijski signal koji modulira ekspresiju grelina tijekom IR ozljede (Slike 4f ​​– h). Naši rezultati također pokazuju da se zaštitni učinak SOD sustava može izvršiti regulacijom lokalno proizvedenog grelina. Općenito je intrigantno primijetiti da, iako je poznato da oksidativni stres testisa štetno utječe na spermatogenezu u brojnim patološkim stanjima, djelovanje grelina u spermatogoniji čini se kao specifičan odgovor na infarkt (dodatna slika 8).

Strukturno, nismo pronašli niti jedan nuklearni lokalizacijski signal (NLS) u sekvenciji aminokiselina grelin. Pa, kako se IR-izazvani grelin prebacio iz citoplazme u nuklearni? Jedna je mogućnost da grelin putuje uz pomoć ostalih regulatora trgovine ljudima u prisutnosti IR stresa. To je vrlo često u drugim regulatorima apoptoze kao što su Rap1 i Ndrg2. 30, 37 Oksidativni stres uzrokovan zračenjem prolazno regulira ekspresiju p53 i induciranu nuklearnu translokaciju p53 u aktivno dijeljenju spermatogonije, gdje p53 djeluje kao faktor transkripcije koji regulira ekspresiju gena koji reagiraju na stres. 38 Konzistentno, pokazali smo da se nuklearna interakcija endogenog grelina i p53 može otkriti samo u ozračenim testisima i uzgojenoj spermatogoniji (slike 5a i c), a in vivo inhibicija signala p53 značajno je poništila nuklearnu izmjenu grelina izazvanog IR-om u spermatogoniji ( Slika 5c). Što se tiče usmjerenosti signala p53 i grelina izazvanog IR-om, mi zaključujemo da (i) ekspresija grelina izazvanog IR-om može zahtijevati p53 kao mehanizam funkcionalne pomoći, sličan zahtjevu p53 signalizacijom grelina u drugoj patogenezi; 39, 40 (ii), s druge strane, grelin može djelovati kao relativno neovisna signalizacija tijekom IR testisa testisa, jer inhibicija grelinom in vivo D-GHRP tretmanom nije utjecala na aktivnost p53 (slika 5e). Uz to, prijavljeno je da p53 povećava oksidativni stres, nakon čega slijedi transkripcijska indukcija ovisna o p53 nekoliko ciljanih gena uključenih u indukciju apoptoze. 41, 42 Logična je hipoteza da su apoptoza i nuklearna translokacija grelina nakon zračenja događaji ovisni o p53.

Ukratko, predlažemo model u kojem IR inducira oštećenje DNA unutar diferencirajuće spermatogonije i u kojem je p53, intracelularno aktivirani apoptotski protein, stabiliziran oksidativnim stresom unutar GC-a kao odgovor na povredu. To zauzvrat dovodi do aktiviranja antioksidacijskog sustava, nakon čega slijedi nuklearna akumulacija grelina. Potonji mogu poslužiti kao međusobni antagonisti p53 i pomoći u održavanju pravilne apoptotske ravnoteže u diferencijaciji spermatogonije. S druge strane, oštećenje intratestikularnog okoliša IR ozljedom rezultira snižavanjem ekspresije grelina u LC-u i posljedičnim porastom proizvodnje androgena tijekom kasnije faze, što može poboljšati oporavak preostalih GC-a nakon ozljede testisa testisa. Općenito, čini se da delikatna regulacija lokalno proizvedenog ghrelina fino podešava mehanizam koji modulira ravnotežu između homeostaze testisa i IR ozljeda testisa (Slika 6).

Image

Sažeti dijagram mogućih mehanizama povezanih sa funkcijom grelina testisa koji doprinose održavanju apoptotske ravnoteže tijekom ranog oporavka nakon IR stresa. Spg, spermatogonija; Spc, spermatociti; Rsd, okrugla spermatida; Esd, izduženi / izduženi spermatid

Slika pune veličine

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

  2. 2.

    Dopunska tablica 1

  3. 3.

    Dopunska tablica 2

Datoteke Powerpoint

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

  6. 6.

    Dopunska slika 6

  7. 7.

    Dopunska slika 7

  8. 8.

    Dopunska slika 8

Glosar

IR

Ionizirana radiacija

LCS

Leydigove stanice

GCS

klice stanica

GHS-R

receptor sekretagoga za hormon rasta

T

testosteron

ROS

reaktivne vrste kisika

SC

Sertolijeve stanice

SCF

faktor matičnih stanica

D-GHRP

[D-Liz-3] -GHRP-6

ZBTB16

cinkov prst i BTB domena koja sadrži 16

POU5F1

POU domena, klasa 5, faktor transkripcije 1

SOHLH2

spermatogeneza i oogeneza specifična osnovna helix-loop-helix 2

LDH-C4

laktat dehidrogenaza C4

GAPHD

gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza

LH

luteinizirajući hormon

FSH

folikula-stimulirajući hormon

MDA

malondialdehid

Vit C / E

vitamin C / E

GPX

glutation peroksidaza

T-SOD

ukupna superoksidna dismutaza

PFT α

pifitrin- α

DEDT

trihidrat natrijeve soli dietilditiokarbaminske kiseline

IP

intraperitonealno

HPG

hipotalamus-hipofiza-gonadalnu

NLS

signal nuklearne lokalizacije

DAPI

4 ', 6-diamidino-2-fenilindol

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)