Protein koji sadrži valozin regulira razgradnju proteasoma dna-pkcs u stanicama glioma | stanična smrt i bolest

Protein koji sadrži valozin regulira razgradnju proteasoma dna-pkcs u stanicama glioma | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Terapijska otpornost na rak
  • Rak CNS-a
  • Radioterapija
  • Ubiquitylation

Sažetak

DNA ovisna protein kinaza (DNA-PK) ima važnu ulogu u popravljanju oštećenja DNA i regulira osjetljivost na stanice glioblastoma na zračenje. VCP (protein koji sadrži valozin), protein kapenera koji regulira razgradnju proteina ovisnih o ubikvitinu, fosforiliran je DNK-PK i regrutovao se na dvamalancijskim lomima DNK radi regulacije popravljanja oštećenja DNK. Međutim, nije jasno je li VCP uključen u razgradnju DNA-PKcs (DNK-PK katalitička podjedinica) ili regulira radiosenzibilnost glioblastoma. Naši podaci pokazali su da je DNA-PKcs bio sveprisutan i vezan na VCP. Otpad VCP-a rezultirao je nakupljanjem proteina DNA-PKcs u stanicama glioblastoma, a inhibitor proteasoma MG132 sinergirao je ovo povećanje. Kao što se očekivalo, ovo povećanje promovira učinkovitost popravljanja DNA u nekoliko staničnih linija glioblastoma; zauzvrat, ova pojačana aktivnost smanjila je osjetljivost na zračenje i produžila frakciju preživljavanja glioblastoma stanica in vitro . Nadalje, obustava VCP-a u stanicama glioblastoma smanjila je vrijeme preživljavanja ksenografisanih miševa radijacijskim zračenjem u odnosu na kontrolne ksenografisane miševe glioblastoma. Pored toga, VCP protein je također smanjen u ∼ 25% GBM tkiva od pacijenata (WHO, astrocitom razreda IV), a razina VCP proteina bila je u korelaciji s preživljavanjem bolesnika ( R2 = 0, 5222, P <0, 05). Ovi nalazi pokazali su da VCP regulira razgradnju DNA-PKcs i povećava osjetljivost GBM stanica na zračenje.

Glavni

Protein koji sadrži valozin (VCP), član je AAA klase ATPaza i povezan je s različitim staničnim aktivnostima. 1, 2 VCP je obilna bjelančevina u citosolu i jezgri, 3, 4 i fiziološki postoji kao homoheksamer. Većina, ako ne i svi, heksameri stvaraju daljnje komplekse s drugim proteinima adaptera, kao što su p47 ili Ufd1-Npl4, 5, 6 i konjugati ubikvitin-proteina u pratnji proteasoma interakcijama protein-protein kako bi se spriječilo stvaranje pretjeranog multiubikvitinskog lanca veličina. 2 Štoviše, nedavni podaci pokazuju da VCP također regulira ubikvitaciju proteina aktiviranjem deubikvitinirajućeg enzima Ataxin-3. 7 Vjeruje se da se VCP usmjerava na relevantne stanične procese kroz diferencirano vezivanje na specifične proteinske adaptere. 8 Svaki VCP protomer sastoji se od četiri regije: N-terminal, dvije ATP-aze (D1 i D2) i C-terminalne regije. 1, 9 Područje N-terminala ima aktivnosti vezivanja na proteine ​​adaptera kao i navvquitinirane proteine. Predloženo je da 1 VCP obavlja mnoge fiziološke stanične funkcije, poput razgradnje proteina posredovane ubikvitin-proteasomskim sustavom. 5, 10, 11, 12, 13, 14

Zanimljivo je da se i VCP regrutuje za mjesta dvostrukog razbijanja DNA (DSBs) interakcijom s BRCA1, p53 i RAD51 i može regulirati popravak oštećenja DNK. 4, 15, 16 Nedavno istraživanje otkrilo je da je VCP novi supstrat DNA ovisne proteinske kinaze (DNA-PK) i ostalih članova PIKK obitelji. 17 Kao odgovor na oštećenje DNK, VCP se fosforilira na Ser 784 unutar njegovog COOH terminala, područje koje je pokazano da cilja VCP na specifične unutarćelijske odjeljke; VCP se zatim akumulira na mjestima DSB-a s lancima ubikvitin ligaze RNF8, ubikvitin adapterom UFD1-NPL4 i lancima ubikvitina (K48-Ub) povezanim s Lys-48. 16 Fosforilacija VCP-a izazvanog oštećenjem DNK i njegovo privlačenje na DSB mjesta sugeriraju ulogu VCP-a u obnavljanju DNK.

DNA-PK je DNA aktivirana serin / treonin protein kinaza sačuvana u kralježnjaka. 18 DNA-PK sastoji se od katalitičke podjedinice (DNA-PKcs) i jednog Ku heterodimera 19, a on se sveprisutno eksprimira u gotovo svim stanicama sisavaca. Brojna su istraživanja pokazala da DNA-PK ima bitnu ulogu u popravljanju DSB-a, posebno u nehomolognom krajnjem spajanju (NHEJ). Nadalje, DNK-PK ne samo da ima kritičnu ulogu u putu popravljanja oštećenja DNA, nego je također uključen u druge važne fiziološke ili patološke procese, 20 kao što su osjetljivost na zračenje, upalni odgovori i metabolička ekspresija gena. 21, 22, 23 Ipak, još uvijek nije poznato kako je regulirana razgradnja proteina DNA-PK i utječe li VCP na osjetljivost na zračenje.

U ovom istraživanju istražili smo povezanost VCP-a s DNK-PKcs i učinak regulacije VCP-a na radiosenzibilnost stanica glioblastoma. Naši podaci pokazali su da je DNA-PKcs bio sveprisutan i vezan na VCP; knockdown VCP doveo je do nakupljanja proteina DNA-PKcs u stanicama glioblastoma i povećao aktivnost DNA-PK, što je na kraju povećalo frakciju preživljavanja GBM stanica poslije IR i skratilo vrijeme preživljavanja ortotopskih ksenografisanih miševa.

Rezultati

VCP je povezan s DNA-PK, a D1 domena VCP je bitna za ovo vezivanje

Prema bioinformatičkoj analizi, protein DNA-PKcs sadrži motiv koji utječe na VCP (VIM) koji se čuva kod sisavaca poput ljudi, majmuna, krava i vukova (slika 1a). Da bi se utvrdilo je li VCP povezan s DNA-PK, provedeno je ko-imunoprecipitacija (co-IP) koristeći DNA-PKcs antitijelo u nekoliko staničnih linija glioblastoma; stanica M059J ima nedostatak DNA-PKcs i korištena je kao negativna kontrola. Western blotsi nakon ko-IP-a pokazali su da se VCP sruši s DNA-PKcs (slika 1b); štoviše, u skladu s našom prethodnom studijom, 24 što je stanica osjetljivija, to se više VCP povezuje s DNK-PK, što ukazuje da VCP može biti povezan sa otpornošću na zračenje. Međutim, zračenje samo po sebi ne utječe značajno na vezanje VCP-a s DNA-PKcs (podaci ne pokazuju).

Image

VCP je bio povezan s DNA-PK. ( a ) Usklađivanje VIM-a i proteina među ljudima, majmunima, kravama i vukovima. ( b ) VCP je srušen DNK-PKcs IP u različitim GBM staničnim linijama (WL: lizat cijelih stanica). DNA-PKcs-deficitarne M059J stanice smatrane su negativnim kontrolama. ( c ) Shematski crtanje skraćenog VCP proteina. Svi skraćenice označene su epitopom Flag (FL: full-length). ( d ) Plazmidi koji eksprimiraju različite domene VCP-a odvojeno su transfektirani u stanice 293T (con: prazni vektor), te je provedena imunmoprecipitacija zastave. Otkriveni su i DNA-PKcs i zastava u cjelovitim lizama (donji paneli, prikazani kao WL) ili u IP-evima zastava (gornji paneli)

Slika pune veličine

Da bi se dalje utvrdilo koja je domena VCP bitna za ovo vezivanje, plazmidi koji sadrže različite VCP domene odvojeno su transfektirani u stanice 293T. Uključujući prazan vektor, dr. Ueffing velikodušno je pružio sedam plazmida, prikazanih na shematskom crtežu na slici 1c. Dva dana nakon transfekcije, čitavi lizati iz 293T stanica podvrgnuti su se Western blot analizi, a 1 mg ukupnog proteina upotrijebljeno je za IP protiv zastave antitijela. Western blotovi nakon IP-a pokazali su da se cijela duljina, izolirana N domena i izolirana D1 domena, ali ne i domena D2, mogu izravno vezati za DNA-PK, a samo ND1 domena fuzijskih proteina može se vezati s DNA-PK, ND2 fuzijski proteini ne mogu se detektirati vezanjem sa DNA-PK, a fuzijski protein D1D2 također slabi afinitet vezanja D1 domene na DNA-PK. Ova opažanja sugeriraju da domena D2 ima negativan utjecaj na vezanje DNA-PK-a s VCP-om, što može biti posredovano s više mehanizama, uključujući međusobno isključive vezivanje ili konformacijske promjene.

Pored toga, protein cijelog VCP imunoprecipitiranog DNA-PKcs bio je manji od imunoprecipitiranog izoliranom N domenom ili D1 domenom; štoviše, ukupni DNK-PKcs protein u 293T ćelijama transficiranim VCP-om također se smanjio. Ova opažanja sugeriraju da je smanjeni signal najvjerojatnije posljedica smanjenog ukupnog DNA-PKcs proteina, te da je prekomjerna ekspresija VCP-a mogla uzrokovati razgradnju DNA-PKcs. Western blot za celične lizate pokazao je da su svi trunkati koji sadrže VCP domene podjednako prekomjerno eksprimirani (donja ploča na slici 1d).

Razgradnja DNA-PKcs ovisi o ubikvitin-proteasomima i regulira se VCP

Da bi se utvrdilo da li razgradnja proteina DNA-PK ovisi o proteasomima i da li VCP regulira razgradnju DNA-PK, VCP je srušen pomoću shRNA posredovane lentivirusom (ovu shRNA potvrdila je druga skupina 26 ) u stanicama U251 ili U87. Western blots pokazali su da je DNK-PKcs reguliran u VCP-obustavljajućim stanicama, dok je prekomjerna ekspresija VCP smanjila količinu DNA-PKcs (slika 2a), što ukazuje da VCP regulira razinu proteina DNA-PKcs. S obzirom na funkciju VCP, VCP može utjecati na razgradnju DNA-PKcs. Da bi se isključila mogućnost da VCP regulira transkripciju DNA-PKcs, proveden je kvantitativni PCR (q-PCR) kako bi se procijenila razina DNA-PKcs mRNA. Razina DNA-Pkcs mRNA detektirana je u VCP-obustavljajućim stanicama, kontrolnim stanicama i roditeljskim stanicama (Slika 2b). Kao što se očekivalo, nije bilo značajne razlike u razinama mRNA DNA-PKcs između VCP obrušavanja U87, kontrolne U87 ili roditeljske U87 stanice, što sugerira da bi VCP mogao regulirati razgradnju DNA-PKcs umjesto da modulira svoju transkripciju.

Image

VCP je regulirao razgradnju DNA-PKcs i ta razgradnja ovisila je o ubikvitin-proteasomu. ( a ) U251 ili U87 stanice su bile zaražene VCP shRNA lentivirusima ili VCP ekspresijom lentivirusa. Imunobloti su izvedeni protiv celično-staničnih lizata (Par: matične U251 stanice; Consi: nespecifična RNA; VCPsi: siRNA specifična za VCP). ( b ) PCR u stvarnom vremenu izveden je korištenjem DNA-PKcs specifičnog prajmera u stanicama U251 zaraženih različitim lentivirusima (Par: matične U251 stanice); Razine mRNA DNA-PKcs su u odnosu na GAPDH. ( c ) Gornja ploča: DNA-PKcs je imunoprecipitiran, i oba DNA-PKcs i ubikvitin su detektirani na istoj membrani (WL: lizati cijelih stanica). Donja ploča: DNA-PKcs otkriven je u matičnim stanicama U251 tretiranim s MG132 (125 nM) za naznačenu dozu. ( d ) Roditeljske stanice U251 ili stanice U251 zaražene različitim lentivirusima tretirane su inhibitorima proteasoma MG132 (50 μM ), a protein DNA-PKcs detektiran je u naznačenim vremenskim točkama. ( e ) Roditeljske stanice U251 ili stanice zaražene različitim lentivirusima tretirane su kloroformom inhibitora lizosoma u naznačenim koncentracijama, a protein DNA-PKcs otkriven je 12 sati nakon tretmana

Slika pune veličine

Budući da razgradnja proteina s VCP-om ovisi o ubikvitin-proteasomima, da bi se utvrdilo je li DNK-PKcs ubikvitiniran, DNA-PKcs je pročišćen putem IP-a i potom detekcijom ubikvitina. Western blot pokazao je da se ubikvitinski signal pojavljivao samo u DNK-PKcs profitiranim U251 stanicama u veličini DNK-PKcs, ali ne i u stanicama M059J s manjkom DNA-PKcs M059J ili nespecifičnom IgG traku, što ukazuje da DNK-PKcs bio je sveprisutan (slika 2c). Da bi se utvrdilo da li razgradnja DNA-PKcs ovisi o sustavu proteasoma, stanice U251 tretirane su inhibitorima proteasoma MG132 (125 nM) i uzete u naznačenim vremenskim točkama (0, 12, 24, 48, 72 h) poluživot proteina DNA-PKcs.

Podaci Western blot-a pokazali su da je razina proteina DNA-PKcs značajno porasla 24 sata nakon tretmana MG132; što je duže trajalo liječenje, to se više nakupljalo DNA-PKcs (slika 2c), što ukazuje da je degradacija DNA-PKcs ovisna o sustavu ubikvitin-proteasoma, iako tipične razmazane trake nisu vidljive, možda zbog visokog molekulska masa DNA-PKcs (460 KD). Da bi se utvrdilo ima li VCP obustava sinergističke učinke na akumulaciju DNA-PKcs s inhibicijom proteasoma, kontrolne i VCP oborene U251 stanice tretirane su s MG132 na određeno vrijeme (0, 3, 6, 12 h). Imunobloti su pokazali da se DNA-PKcs dramatično povećao u VCP-urušenim U251 stanicama 3 sata nakon tretmana MG132 (slika 2d). Nadalje, da bi se isključila mogućnost da ovo povećanje ovisi o lizosomima, oborene VCP stanice U251 tretirane su klorokinom inhibitorom lizosoma u naznačenoj koncentraciji. Western blot pokazao je da klorokvin nema učinka na akumulaciju DNA-PKcs, čak 6 sati nakon tretmana; za razliku od toga, klorokvin je smanjio razinu proteina i DNA-PKcs i VCP (slika 2e). Ukratko, naši podaci pokazali su da je DNA-PKcs bio sveprisutan i da VCP regulira razgradnju DNA-PKcs kroz sustav ubikvitin-proteasoma.

Srušenje VCP-a pojačava DNK-PK aktivnost i povećava učinkovitost popravljanja oštećenja DNA

Da bi se utvrdilo regulira li VCP aktivnost DNA-PK kao i razinu proteina DNA-PKcs, endogena DNA-PK aktivnost direktno je procijenjena putem in vitro kinaznog testa, a neizravno mjerena fosforilacijom endogene RPA32 (podjedinica replikacije 32 kDa protein A). Iako je RPA32 različito fosforiliran s tri PI3K (ataksije telangiektazije mutirani protein, ATM, protein povezan sa ATM-Rad3 i DNA-PK) kao odgovor na različita sredstva koja oštećuju DNK, DNK-PK je primarna kinaza odgovorna za kamptotecin (CPT) -inducirana Fosforilacija RPA32; Prema tome, 27, 28, 29, 24 fosforilacija izazvana CPT-om je još jedan pokazatelj aktivnosti DNA-PK.

U ispitivanju in vitro kinaze, naši podaci pokazali su da se DNA-PK aktivira ionizirajućim zračenjem i da je padanje VCP pojačalo ovu aktivaciju, što je bilo jedan i pol puta više nego u kontrolnim stanicama, kao što je prikazano na prvoj slici na slici 3a, Kao odgovor na tretman CPT, fosforilacija RPA32 Ser 4/8 uočena je kao pojava smanjene pokretljivosti u odnosu na roditeljski RPA32 pojas, a ovaj pomaknuti pojas potvrđen je antitijelom specifičnim za fosforilaciju. Ova fosforilacija RPA32 izazvana CPT-om u roditeljskim U251 stanicama, U251 stanicama s VCP oborenjem ili kontrolnom siRNA (slika 3a) analizirana je denzitometrijom pomoću ImageJ softvera (NIH, USA). Odnos fosforiliranog RPA32 (gornja ploča) prema ukupnom RPA32 (dvije vrpce na drugom panelu), što predstavlja DNK-PK aktivnost, izračunato je u svakoj traci. Omjer p-RPA32 u VCP obrušenim U251 ćelijama bio je dva puta više nego u kontrolnom U251, kao što je prikazano na posljednjoj slici na Slici 3a. Ukupni RPA32 je porastao u VCP-obustavljajućim ćelijama, ali uzrok tome nije poznat.

Image

VCP knockdown povećao je DNA-PK aktivnost i promovirao učinkovitost popravljanja oštećenja DNA. ( a ) Roditeljske stanice U87 ili stanice zaražene kontrolnim lentivirusima ili VCP shRNA lentivirusima tretirane su s 5 Gy zračenja ili kamptotecinom (20 μM ). Ispitivanje in vitro kinaze provedeno je na stanicama tretiranim zračenjem. Stanice tretirane s CPT podvrgnute su imunoblotu, a ser 4/8 fosforilacija RPA32 otkrivena je denzitometrijskom analizom 2 sata nakon tretmana (stupci predstavljaju prosjek ± SD, provedena su tri neovisna eksperimenta). Izračunat je omjer fosfor-RPA32 prema ukupnom RPA32 i vrijednost je normalizirana na gustoću p- aktina. ( b ) U87 stanice zaražene kontrolnim lentivirusima ili VCP shRNA lentivirusima tretirane su s 5 Gy zračenja; stanice su skupljene u naznačenim vremenskim točkama za ispitivanje komete, a 100 stanica u svakoj skupini izmjereno je za vrijednost OTM i duljinu repa. ( c ) U87 stanice s kontrolnim lentivirusima ili VCP shRNA lentivirusi imunostanirane su s γ -H2AX nakon primanja zračenja od 2 Gy; Prebrojeno je 100 stanica, a grafika prikazuje prosječni broj žarišta po ćeliji u naznačenim vremenskim točkama (crvena: γ -H2AX; plava: DAPI). (Par: matične stanice U87; Consi: nespecifična RNA; VCPsi: siRNA specifična za VCP)

Slika pune veličine

Štoviše, provedeni su COMET test i otkrivanje γ- H2AX, koji predstavljaju razinu oštećenja DNA u svakoj stanici, kako bi se procijenila učinkovitost popravljanja oštećenja DNA. U testu COMET, stanice su ozračene ledom od 10 Gy. Tretirane stanice su sakupljene i oporavljene određeno vrijeme (30, 180, 360 min), a stanice su podvrgnute jednoćelijskoj elektroforezi u neutralnim uvjetima. Svako vrijeme izmjereno je 200 stanica za svaku skupinu uz 200-puta povećavanje. Izmjerene su duljine repa, a vrijednosti Olive moment-olov (OTM) izračunate su korištenjem CASP softvera na temelju formule: OTM = repna DNK% × (srednja vrijednost repa - sredina glave). Nakon 30 min, nije bilo značajne razlike između kontrolnih U251 stanica i VCP-downdown. Međutim, nakon 3 ili 6 h oporavka, duljine repa ili OTM vrijednosti očigledno su duže ili veće u kontrolnim stanicama U251 u usporedbi s onim u VCP obrušenim U251 stanicama ( P <0, 05), kao što je prikazano na slici 3b, što sugerira taj VCP knockdown promovirao je učinkovitost popravljanja DNK.

Nadalje, još jedan marker oštećenja DNA, γ -H2AX žarišta, također je uračunat u stanicama U251 tretiranim s 2 Gy zračenja (podaci s drugim dozama zračenja nisu prikazani). Sat vremena nakon zračenja, opaženi su masivni γ -H2AX žarišta i u U251 kontrolnim stanicama i u VCP-porušenim stanicama, a gotovo svaka pojedina stanica sadržavala je brojne žarišta (crvene točkice). Šest sati nakon zračenja, većina kontrolnih stanica nije imalo dramatične promjene u γ -H2AX obojenju, dok su žarišta u polovici VCP-obrušenih stanica nestala ( P <0.01) (Slika 3c). Na kraju, i kontrolne i VCP stanice obrušavanja nisu imale žarišta koja su se otkrila nakon 24 sata oporavka. Sva ta opažanja pokazuju da obaranje VCP pojačava aktivnost DNA-PK i povećava učinkovitost popravljanja oštećenja DNA.

VCP knockdown povećava udio preživljavanja GBM stanica nakon zračenja i skraćuje preživljavanje ortotopskih ksenografisanih miševa

Da bi se utvrdilo regulira li VCP zračenje osjetljivosti GBM na stanice, u ovom su ispitivanju korišteni in vitro klonogeni test i in vivo ortotopski model miša. U klonogenom testu signalizirane VCP oborene U87 stanice ili U251 stanice su posijane u 100 mm posude (400 stanica svaka); stanice su ozračene na navedenoj dozi, a zatim su kultivirane kroz 2 tjedna. Prebrojane su kolonije koje sadrže 50 ili više stanica. VCP knockdown povećao je opstanak frakcije i u stanicama U251 i u U87. Nakon 2 Gy zračenja, obustava VCP pospješila je preživljavanje stanica U251 od 29, 3 do 51, 3% ( P <0, 01) i preživljavanje U87 stanica od 34, 9 do 62, 3% ( P <0, 01) (Slika 4a). U87 stanice su bile otpornije na zračenje od stanica U251, što je bilo u skladu s našim prethodnim istraživanjem. 24 Nije bilo značajnih učinaka na preživljavanje između kontrolnih i roditeljskih U251 ili U87 stanica. Da bi se dodatno potvrdilo da li povećana otpornost na zračenje ovisna o VCP ovisi o DNK-PK, u ovoj su studiji upotrijebljeni par DNK-PKcs-poznatih (M059K) i deficitarne (M059J) GBM stanice. Naši podaci pokazali su da pad VCP značajno poboljšava preživljavanje M059K ćelija koje posjeduju DNK-PK, ali ne i M059J stanice sa nedostatkom DNA-PK, pokazujući da otpornost na zračenje uzrokovana VCP ovisi o DNK-PK.

Image

VCP knockdown povećao je otpornost na GBM stanice. ( a ) Matične stanice U251, U87, M059K, M059J ili stanice zaražene kontrolnim lentivirusima ili VCP shRNA lentivirusima odvojeno su posijane u posude veličine 10 cm (400 stanica po posudi), klonogeni testovi su provedeni nakon tretmana zračenjem u naznačenim dozama i frakcija preživljavanja je normalizirana da kontrolira stanice. ( b ) Krivulja preživljavanja Kaplan-Meier napravljena je za ortofopske GBM miševe u četiri skupine (* P <0, 05); povećanje zračenja vremena preživljavanja izračunato je na osnovu formule: povećanje zračenja vremena preživljavanja = produženo vrijeme preživljavanja / vrijeme preživljavanja bez zračenja. ( c ) Prosječna veličina tumora i reprezentativne MR slike u svakoj skupini i reprezentativne VCP imunofluorescentne slike (crvene) u ksenografskim presjecima glioblastoma. ( d ) Korelacijska analiza razine VCP proteina s preživljavanjem bolesnika i reprezentativne slike imunohistokemije VCP u parafinskim odjeljcima bolesnika sa glioblastomom. ( e ) Reprezentativne slike iz svake skupine (Con: para-tumorsko tkivo)

Slika pune veličine

U ortotopskom modelu miša, U87 stanice zaražene praznim virusima služile su kao kontrola, a ukupno je ubrizgano 48 miševa. Devet dana nakon injekcije, miševi koji nose tumor (39 miševa) nasumično su podijeljeni u dvije skupine prema MRI snimanju, uključujući IR i ne-IR zračenje. Svaka skupina sadržavala je podgrupe za kontrolu i rušenje (10 miševa u svakoj podskupini). 6 Gy ukupnog zračenja primijenjeno je tri puta u toku 1 tjedna; raspored je opisan u odjeljku Materijali i metode. Zabilježeno je vrijeme preživljavanja svakog miša, a sva vremena preživljavanja u svakoj skupini analizirana su korištenjem Kaplan-Meierove metode. Naši podaci pokazali su da je liječenje zračenjem produljilo vrijeme preživljavanja miševa u svim skupinama. S zračenjem, miševi u VCP grupi koja je oborila preživjeli su kraće vrijeme (38, 4 dana, srednje vrijeme preživljavanja) od miševa u kontrolnim skupinama, čije je vrijeme preživljavanja bilo 53, 8 dana (Slika 4b). Bez zračenja, vrijeme preživljavanja u VCP grupi koja je oborena bilo je nešto kraće nego u kontrolnoj skupini. Omjer poboljšanja zračenja vremena preživljavanja u VCP grupi koja je obustavljena bila je 2, 69%, što je znatno niže nego u kontrolnoj skupini (27, 1%); razlika je bila statistički značajna ( P <0, 001) (slika 4b).

Na temelju MRI slike tumora 9. dana nakon intrakranijalne injekcije, veličina tumora u svakoj skupini se razlikovala, ali ne i značajno, kao što se vidi na reprezentativnim slikama na srednjoj slici na slici 4c. Kao što smo i očekivali, veličine tumora u grupi s obustavom VCP-a u 29. danu očito su bile veće od one u istom mišju 9. dana, kao što je prikazano na reprezentativnim slikama u desnom stupcu srednje slike (slika 4c). Prosječne količine tumora u svakoj skupini izračunale su se i prikazane na slici 4c. Veličine tumora smanjile su se više (28, 9%) u kontrolnoj skupini nego u VCP-grupi koja se srušila (6, 3%) nakon zračenja. Reprezentativne slike fluorescentne imunostakcije u razini proteina VCP u ksenografisanom GBM prikazane su na slici 4c.

Za daljnje istraživanje ekspresije VCP i njegovih učinaka na osjetljivost GBM na zračenje, ekspresija VCP proteina u GBM odjeljcima pacijenata (stupanj IV astrocitoma) polukvantificirana je softverom za kvantitativnu analizu Tissue IA (Leica, Solms, Njemačka) i korelacijom preživljavanja vrijeme je analizirano. Sve su digitalne slike normalizirane na negativnu kontrolu. Ocjene manje od 10% smatrale su se "-"; ocjene veće od 10% i manje od 25% smatrale su se "+"; a rezultati više od 25% smatrali su se "++". Podaci su pokazali da je VCP različito eksprimiran u tkivu GBM i da je razina ekspresije VCP-a pozitivno povezana s vremenom preživljavanja pacijenata ( R 2 = 0, 5222, P <0, 05). Pacijenti s visokom razinom VCP-a dulje bi preživjeli od zračenja (slika 4d). Reprezentativne slike prikazane su na slici 4e. Ovo je promatranje bilo u skladu s našim podacima o životinjama.

Rasprava

Prvo smo otkrili da je DNK-PKcs sveprisutan i vezan na VCP; tretman inhibitorom proteasoma (MG132), ali ne inhibitorom lizosoma (klorokin), povećao je razinu proteina DNA-PKcs; knockdown VCP imao je sinergistički učinak s tretmanom MG132 na akumulaciju proteina DNA-PKcs. Kao nosač, VCP se veže na polubikvitinirani protein i dostavlja ga u sustav proteasoma radi razgradnje; prema tome, ili inhibicija proteasoma ili obustava VCP povećala je razinu proteina DNA-PKcs, a kombinacija oba sinergistički povećala razinu proteina DNA-PKcs. Ta su opažanja pokazala da VCP regulira razgradnju proteina DNA-Pkcs, što ovisi o ubikvitin-proteasomima. Zanimljivo je da je tretman MG132 također povećao razinu samog VCP proteina, što sugerira da je razgradnja VCP-a također regulirana ubikvitin-proteasomskim sustavom. Štoviše, liječenje klorokinom neočekivano je smanjilo razinu proteina i DNA-PKcs i VCP u stanicama glioblastoma, što ukazuje da inhibicija lizosoma može poboljšati razgradnju proteasoma ili razgradnju povezanu sa endoplazmatskim retikulumom na kompenzacijski način.

Nadalje, iako se smatra da je DNK-PK nukleolusni protein, naše promatranje sugerira da se DNK-PK, ili barem njegova katalitička podjedinica, također nalazi u citoplazmi21 i da je VCP s njom povezan i regulirao njegovu razgradnju. Co-IP eksperimentom je utvrđeno da se i N-terminalna domena i D1 domena VCP proteina mogu vezati na DNA-PK, što je u skladu s nedavnim nalazima eksperimenata interferometrije co-IP i biosloja pomoću VIM peptida gp78; 30 ovaj zaključak je također djelomično u skladu s ranim podacima koji su pokazali da rodopsin (P23H) protein djeluje samo s p97ND1 domenom, ali ne i s izoliranom domenom p97N. 25 Međutim, VCP ND2 domena ne otkriva vezanje s DNA-PKcs, a D1D2 domena također slabi afinitet vezanja D1 domene s DNA-PKcs. Ovi rezultati pokazuju da na VCP povezanost s ciljanim proteinom utječu konformacijske promjene, koje mogu biti inducirane ATP vezanjem / hidrolizom ili hijerarhijskim vezanjem. Nadalje, objavljeno je da jedna pojedinačna supstitucija aminokiselina (R155H) na sučelju između N-terminalne domene i susjedne AAA domene (D1) VCP rezultira smanjenim afinitetom za ADP. Iako su prethodni podaci pokazali da je VCP fosforilirao DNA-PK kao odgovor na oštećenje DNA, nije jasno utječe li ta fosforilacija VCP na njegovo vezanje s DNA-PK ili regulira aktivaciju VCP.

Pored toga, biokemijska i strukturna ispitivanja pokazala su da višestruki kofaktori prepoznati pomoću VCP (p97) sadrže regulirajuću domenu ubikvitina X (UBX) prisutnu u familiji proteina UBX ili domenu NPL4 nalik ubikvitinu. 30 Uz činjenicu da je VCP fosforiliran na Ser 784, DNA-PKcs sadrži i VIM motiv 'AAXXR' (slika 1a), koji je sačuvan kod sisavaca i u skladu je s prethodnim nalazom. 30 Naši podaci također su pokazali da je DNA-PKcs ubikvitiniran, a njegova razgradnja ovisi o ubikvitin-proteasomima; međutim, specifična sveprisutna mjesta DNA-PKcs i odgovarajuća E3 ligaza još uvijek nisu otkrivena i bit će razmatrana u našim budućim studijama.

DSB je najsmrtonosnija vrsta oštećenja DNA; ako stanica ne može popraviti ovo oštećenje, ne popravljeni DSB-ovi mogu rezultirati smrću stanice. Kao središnja komponenta NHEJ-a, DNA-PK kontrolira proces popravljanja DSB-a i održava stabilnost genoma. Promjene u DNA-PK aktivnostima ili količinama proteina DNA-PKcs najvjerojatnije će promijeniti osjetljivost stanica na genotoksični stres, poput zračenja. Poznato je da su DNA-PKcs - / - miševi preosjetljivi na zračenje i podvrgnuti apoptozi ovisnoj o ATM i p53. 32, 33, 34 Međutim, podaci iz TCGA i naše skupine sugeriraju da nema značajne razlike u razini proteina DNA-PKcs između normalnog glialnog tkiva i GBM tumorskog tkiva, iako je u nekim slučajevima imunohistokemijska analiza pokazala da tumorske stanice izražavaju više DNK -PKcs nego susjedno normalno tkivo, 35 što može biti posljedica specifičnosti tkiva.

Kako bi se izbjegle potencijalne nuspojave uzrokovane DNA-PK inhibitorima, ciljanje DNA-PK regulatornih proteina koji su regulirani u stanicama glioblastoma otpornim na zračenje je alternativna strategija za liječenje radiosenzibilizacijom. Prethodno smo otkrili da proteinska fosfataza PP6 regulira osjetljivost GBM stanica putem DNA-PK i da obaranje PP6c povećava vrijeme preživljavanja miševa; štoviše, PP6c je bio prekomjerno izražen kod 44, 7% (17 od 38 slučajeva) bolesnika s GBM. 21, 22, 36, 37, 24

U ovom istraživanju obaranje VCP-a ne samo da je prouzročilo nakupljanje proteina DNA-PKcs, već je i povećalo aktivnost DNA-PK i povećalo učinkovitost popravljanja oštećenja DNA u GBM stanicama. Iako je knockdown VCP utjecao na regrutovanje 53BP1 na mjesta oštećenja DNA i činilo se da povećava osjetljivost na zračenje U2OS stanica i nematode, 15, 16 naši podaci pokazali su da nakupljanje DNA-PK povećava učinkovitost popravljanja oštećenja DNA u GBM stanicama, što bi moglo biti rezultat putova neovisnih o p53 i različitih staničnih uloga VCP-a u različitim vrstama stanica. 38 Naše istraživanje in vivo potvrdilo je da knockdown VCP smanjuje radiosenzitivnost i skraćuje vrijeme preživljavanja miševa u GBM ortotopskom modelu. Klinički podaci također su podržali ovaj zaključak. Stoga male molekule koje selektivno ciljaju VCP protein mogu utjecati na osjetljivost na zračenje reguliranjem razine proteina DNA-PK. Ova opažanja sugeriraju da su DNA-PK regulatorni proteini potencijalna meta za liječenje radiosenzibilizacijom.

Glosar

VCP

protein koji sadrži valozin

DNA-PK

DNA ovisna o protein kinazi

ER

endoplazmatski retikulum

ERAD

ER-povezana razgradnja proteina

DSB

Slom dvostrukog lanca DNA

VIM

VCP motiv

NHEJ

nehomologno krajnje spajanje

ATR

ATM-Rad3 povezan protein

bankomat

ataksija telangiektazije mutirani protein

CPT

CamptothecinTM