Autofigija ovisna o wipiju tijekom neutrofilne diferencijacije nb4 akutnih stanica promielocitne leukemije | stanična smrt i bolest

Autofigija ovisna o wipiju tijekom neutrofilne diferencijacije nb4 akutnih stanica promielocitne leukemije | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • autophagy
  • Stanična signalizacija
  • Leukemija
  • neutrofili

Sažetak

Članovi WD-ponavljanog proteina u interakciji s fosfoinozidima (WIPI) iz porodice su efektori fosfatidilinozitola 3-fosfata (PI3P) koji su neophodni za stvaranje autofagosoma. Autofhagosomi, jedinstveni organeli s dvostrukom membranom, karakteristični su za autofagiju, masivni mehanizam razgradnje s citoprotektivnom i homeostatskom funkcijom. Oboje, WIPI-1 i WIPI-2 se ablerantno eksprimiraju u nekoliko solidnih tumora, povezujući ove gene s karcinogenezom. Sada smo otkrili da je ekspresija WIPI-1 značajno smanjena u velikoj skupini 98 uzoraka bolesnika s primarnom akutnom mijeloidnom leukemijom (složeni kariotipi; t (8; 21); t (15, 17); inv (16) ). Suprotno tome, ekspresija WIPI-2 smanjena je samo u akutnoj promielocitnoj leukemiji (APL), posebnom podtipu AML (t (15, 17)). Kako su stanice AML blokirane u njihovoj diferencijaciji, testirali smo da li se razina ekspresije WIPI-1 i WIPI-2 povećava tijekom diferencijacije neutrofila APL izazvane retinojskom kiselinom (ATRA). Prema većoj ekspresiji WIPI-1 u granulocitima u usporedbi s nezrelim blast ćelijama, ekspresija WIPI-1, ali ne WIPI-2, značajno je inducirana tijekom neutrofilne diferencijacije NB4 APL stanica. Zanimljivo je da je indukcija ekspresije WIPI-1 ovisila o transkripcijskom faktoru PU.1, glavnom regulatoru mijelopoeze, što potvrđuje našu predodžbu da je ekspresija WIPI-1 smanjena kod bolesnika s AML koji nemaju odgovarajuću aktivnost PU-1. Nadalje, obaranje WIPI-1 u NB4 stanicama značajno je oslabilo autofagični tok i značajno smanjilo diferencijaciju neutrofila. Ovaj rezultat je također postignut obaranjem WIPI-2, što sugerira da su i WIPI-1 i WIPI-2 funkcionalno potrebni i nisu suvišni u posredovanju PI3P signala na početku autofagije u NB4 stanicama. U skladu s tim podacima, regulacija PI3KC3 (hVPS34), koja stvara PI3P uzvodno od WIPI, također je inhibirala neutrofilnu diferencijaciju. Zaključno, pokazujemo da su i WIPI-1 i WIPI-2 potrebni za autofagičnu aktivnost ovisnu o PI3P tijekom neutrofilne diferencijacije i da je ekspresija WIPI-1 ovisna o PU.1 značajno potisnuta u primarnim uzorcima bolesnika s AML-om i da je indukcija autofagičnog toka povezan je s neutrofilnom diferencijacijom APL stanica.

Glavni

Makroautofagija (u daljnjem tekstu autofagija) ili stanična samo-probava jeste: (a) uključeni u održavanje stanične homeostaze, (b) odgovorni za konstitutivni promet citoplazmatskog materijala i dugovječnih proteina koji su oštećeni ili funkcionalno suvišna, (c) visoko očuvana i (d) povezana s različitim bolestima, uključujući neurodegenerativne poremećaje i rak. 1, 2, 3 Put ubikvitin-proteasoma, s druge strane, radije sudjeluje u razgradnji kratkotrajnih proteina. 4 Autofhagija se uglavnom sastoji od četiri koraka i slijedi hijerarhijski uređeno regrutovanje proteina povezanih s autofagijom (ATG) na mjesto sastavljanja fagofora (PAS). Prvo, korak inicijacije kritično uključuje kompleks ULK1, koji regulira sljedeći korak nukleacije aktiviranjem fosfatidilinozitol-3-kinaze III klase (PI3KC3) kinaza, što u konačnici rezultira stvaranjem autofagosomskog prekursora, nazvanog fagofor. Daljnji koraci uključuju aktivnost dva sistema konjugacije sličnih ubikvitinu i proizvod LC3-PE (ili LC3-II) koji je potreban za produženje i zatvaranje fagofora za stvaranje autofagosoma. 5

Tijekom koraka nukleacije, PI3KC3 djeluje zajedno s Beclinom 1, VPS15 i ATG14L za proizvodnju PI3P. Ovaj PI3P signal je ključan za stvaranje autofagosoma, o čemu svjedoči činjenica da je uporaba PI3K inhibitora (wortmannin, 3-MA, LY29002) u koncentracijama preferencijalnim blokiranjem PI3KC3 ukinute autofagije 6, 7, 8 (pregledano u Petiot i dr. 9 ), Transdukcija PI3P signala odvija se preko specifičnih efektora koji vežu PI3P, uključujući protein DFCP110 domene FYVE i protein WP-ponavljanja u interakciji s protein-familijom fosfoinozida (WIPI) beta-propelera. 11 Ljudska obitelj WIPI sastoji se od četiri člana (WIPI-1 do WIPI-4) s različitim izoformama. 11 Do danas su humani WIPI-1, WIPI-2 i WIPI-4 proteini bili funkcionalno povezani s procesom autofagije. 11, 12, 13, 14 WIPI proteini funkcioniraju kao autofagični PI3P efektni proteini sa sposobnošću vezivanja autofagosomske membrane, 15 i prelaze iz citosola u PAS koji se formira. Nakon toga postaju membranski proteini autofagosomske membrane, vidljivi fluorescentnom mikroskopijom kao punktatne strukture. 15

Akutna mijeloidna leukemija (AML) karakterizira blok diferencijacije mijeloida u različitim fazama i predstavlja najčešću akutnu leukemiju u odraslih. 16 Potrebno je poboljšati trenutnu diferencijaciju i citotoksične terapije za AML, s izuzetkom nekoliko podskupina s povoljnom genetskom bolešću. Nedavno smo objavili da je autofagija ključna za diferencijacijsku terapiju APL bolesnika, 17, 18, 19, 20, 21 bolesti koja je karakterizirana translokacijom t (15; 17) što rezultira u ekspresiji onkogenog PML-RARA fuzijskog proteina. i nakupljanje promeelocitnih stanica. Ipak, podaci o molekularnim mehanizmima koji stoje na osnovi ove autofagije povezane s mijeloidnom diferencijacijom su nedostatni i opravdana su daljnja ispitivanja ovog određenog autofagičnog puta.

Ovdje pokazujemo da je potreban autofagiji ovisan o PI3P za neutrofilnu diferencijaciju AML stanica. Otkrili smo da je ekspresija mRNA WIPI značajno potisnuta u kliničkim uzorcima AML koja je povezana s fenotipom nezrele mijeloidne diferencijacije. Genetička primjena WIPI ili PI3KC3, ali ne i Beclin 1 funkcije, rezultirala je značajno atenuiranom diferencijacijom neutrofila APL stanica. Naši podaci pružaju dokaz da je autfagija posredovana WIPI kritična za diferencijaciju stanične mijeloične leukemije i da je kompromitirana u AML.

Rezultati

Aberantna ekspresija WIPI u primarnim uzorcima bolesnika s AML i indukcija ekspresije W.1I ovisna o PU.1 tijekom neutrofilne diferencijacije APL stanica

Na temelju presudne uloge WIPI proteina kao PI3P efektora u autofhagiji 11, 12, 13, 15 i početnih nalaza, da su svi humani WIPI geni aberantno i različito eksprimirani u mnoštvu čvrstih tumora, 11 kvantificirali smo Ekspresija gena WIPI-1 i WIPI-2 u kliničkim uzorcima bolesnika s AML. Otkrili smo da je obilje WR-1 mRNA značajno smanjeno u našoj skupini bolesnika s AML-om ( n = 98) u usporedbi s ekspresijom WIPI-1 u zdravim granulocitima ( n = 13; Slika 1a, lijeva ploča). Pobliže rečeno, WIPI-1 poruka je smanjena u složenom kariotipu ( n = 24), t (8, 21) ( n = 20), t (15; 17) ( n = 20) i inv (16) ( n = 16) AML podtipovi, ali nisu u normalnom kariotipu AML ( n = 18; Slika 1a, desne ploče). Suprotno tome, ekspresija mRNA WIPI-2 bila je značajno inhibirana samo u bolesnika sa APL (t (15; 17)), posebnog podtipa AML (dopunska slika 1a). Štoviše, WIPI-1 je trostruko veći izražen u zdravim granulocitima u usporedbi s normalnim stanicama CD34 + porijekla (Slika 1a, lijeva ploča), dok je WIPI-2 podjednako izražen u obje ove stanične populacije (Dopunska slika 1a). Ukratko, pronašli smo pozitivnu povezanost između niske WIPI-1 ekspresije i nezrelog mijeloidnog fenotipa.

Image

Otkriveno je značajno smanjenje ekspresije WIPI-1 mRNA u primarnim uzorcima bolesnika s AML i porast ekspresije WIPI-1 nakon ATRA tretmana NB4 stanicama NBL. ( a ) Razine WIPI-1 mRNA granulocita zdravih davatelja i uzoraka bolesnika s AML izmjerene su primjenom qPCR. Podaci predstavljaju log2 nivoe ekspresije i normalizirani su na razine ekspresije dvaju gena za održavanje HMBS i ABL. Radi bolje čitljivosti, rezultate smo pomnožili s (−1) i isključili Ct vrijednosti veće od 40 (Δ C t = 40 − Ct WIPI-1 - (Srednja vrijednost C t HMBS i C t ABL1 ) × (−1)). ( b ) Razina mRNA ekspresije WIPI-1 izmjerena je u kontroli, te ATRA-tretirane stanične linije NB4, NB4-R2 APL na dan 4 koristeći qPCR. Vrijednosti su normalizirane u generičkom održavanju HMBS-a i dane su kao n-kratna ekspresija mRNA u odnosu na kontrolu dana 4. ( c, d ) Povećanje endogene WIPI-1 puncta detektirano je konfokalnom mikroskopijom i dalje kvantificirano pomoću ImageJ softvera. ( e ) PI3P: Test vezanja WIPI-1 staničnih lizata iz NB4 stanica tretiranih s 1 μM ATRA 6 dana. Svaka membrana je napunjena s jednakim ukupnim proteinskim lizatom. MWU, * P <0, 05. ** P <0, 01, *** P <0, 001. MWU, Mann-Whitney U- test

Slika pune veličine

Da bismo funkcionalno procijenili ulogu WIPI-1 i WIPI-2 u ATRA-induciranoj neutrofilnoj diferencijaciji mijeloidnih leukemijskih stanica, koristili smo NB4 APL stanice kao model. NB4 stanice se diferenciraju prema neutrofilnim stanicama davanjem ATRA. U skladu s većom ekspresijom WIPI-1 u zrelim neutrofilima u usporedbi s AML blast ili CD34 + progenitornim stanicama (slika 1a), ATRA tretman NB4 stanica rezultirao je značajnom trostrukom i četverostrukom uregulacijom WIPI-1 mRNA na dan 4 i 6, odnosno (Slika 1b, gornja ploča). Važno je da se razine mRNA WIPI-1 nisu promijenile u AT4-rezistentnim stanicama NB4-R2 (slika 1b, donja ploča) što ukazuje da povećanje regulacije WIPI-1 ekspresije nije posljedica stohastičkog stresnog odgovora na ATRA primjenu. Konačno, razina mRNA WIPI-2 nije se promijenila niti tijekom neutrofilne diferencijacije stanica NB4 niti u stanicama NB4-R2 (dopunska slika 1b).

Da bismo nadzirali autofagični status, procijenili smo lokalizaciju endogenog WIPI-1 proteina u stanicama NB4 tijekom neutrofilne diferencijacije imunocitohemijom. Pomoću ove metode snimanja, prisutnost fluorescentne WIPI-1 puncta pouzdano odražava stvaranje autofagosomske membrane. 15 Zapravo, značajan porast WIPI-1 punkta po stanici izmjeren je ATRA-induciranom diferencijacijom neutrofila (Slike 1c i d). Kako se WIPI-1 specifično veže za PI3P, 15 postavili smo pitanje može li povećana ekspresija WIPI-1 nakon ATRA tretmana (Slika 1b, gornja ploča) rezultirati većim udjelom vezanja proteina WIPI-1 na PI3P. Zapravo, ispitivanje prekrivanja fosfolipid-protein s ekstraktima matičnih stanica otkrilo je da se endogeni protein WIPI-1 iz NB4 tretiranih ATRA stanicama vidljivo veže na imobilizirani PI3P u usporedbi s netretiranim stanicama ( n = 3, reprezentativan rezultat dat je na slici 1e ). Zadovoljavajući, ovaj rezultat je također potvrdio da se endogeni WIPI-1 izvađen iz NB4 APL ispravno veže za PI3P.

Da bismo provjerili može li se niska ekspresija WIPI-1 u nezrelim AML blast pripisati aberrantnoj regulaciji transkripcije faktorima mijeloidne transkripcije, analizirali smo genomsku regiju od 5, 8 kb uzvodno od početnog mjesta transkripcije WIPI-1 za pretpostavljena mjesta vezivanja ključnog mijeloidnog transkripcijskog faktora PU.1 pomoću MatInspektora. Identificirali smo 4 moguća PU.1 mjesta vezivanja (A – D) u 5 '-promotorskom području WIPI-1 (Slika 2a). Korištenjem kromatinskih imunoprecipitacija i anti-PU.1 antitijela, pronašli smo vezanje PU.1 na sva 4 mjesta vezivanja PU.1 (A – D) u 5'-promotoru humanog WIPI-1 (Slika 2b). Kako bismo pokazali regulaciju ekspresije WIPI-1 ovisno o PU.1, ili smo srušili ili prekomjerno izrazili PU.1 u NB4 APL stanicama. Smanjivanje indukcije ekspresije gena WIPI-1 oslabljene s PU.1 nakon ATRA tretmana (slika 2c), dok je tretman tamoksifenom inducibilnim PU.1-ER fuzijskim proteinom doveo do značajne dvostruke indukcije ekspresije WIPI-1 (slika 2d).

Image

WIPI-1 regulacija ovisna o PU.1 u NB4 stanicama APL. ( a ) Shematski prikaz fragmenta promotora ljudskog WIPI-1 od 5, 8 kb. Pomoću MatInspector-a pronađena su 4 vjerojatna PU.1 mjesta vezivanja (krugovi) u ljudskom promotoru WIPI-1. ( b ) In vivo vezanje PU.1 na 4 mjesta vezivanja pokazao je ChIP u NB4 stanicama koristeći antitijela protiv PU.1. Antitijela protiv acetil-histona H3 i IgG poslužila su kao pozitivne i negativne kontrole. GAPDH pojačanje prikazano je kao negativna kontrola za različite pada. ( c ) Gornja ploča: Ekspresija mRNA WIPI-1 izmjerena je u knockdown ćelijama NB4 shPU.1 nakon tretiranja ATRA na dan 4. Donja ploča: PU.1 analiza zapadnog blota NB4 SHC002 kontrolne stanice i PU.1 oborene stanice. Za kontrolu opterećenja upotrebljena je ukupna ekspresija proteina. ( d ) NB4 stanice, transducirane s inducibilnim PU-1-ER eksprimirajućim vektorom, tretirane su s 4-OHT kako bi se inducirala translokacija PU.1 u jezgru. Razine mRNA WIPI-1 ocijenjene su qPCR-om i normalizirane na HMBS vođenje kućnog gena. Rezultati se daju kao n-kratna regulacija u usporedbi s netretiranim, kontrolnim transduciranim stanicama NB4 pBabe. MWU, *** P <0, 001. MWU, Mann-Whitney U- test

Slika pune veličine

Zajedno smo otkrili da PU.1 regulira ekspresiju WIPI-1 tijekom diferencijacije neutrofila.

Inhibiranje WIPI-1 ili WIPI-2 značajno smanjuje neutrofilnu diferencijaciju

Bavili smo se pitanjem je li WIPI-1 potreban za ATRA-induciranu diferencijaciju neutrofila upotrebom lentivirusno isporučene šRNA ciljajući WIPI-1. Jasno, spuštanje WIPI-1 oslabljene diferencijacije neutrofila o čemu svjedoči značajno snižena razina proteina CD11b i mRNA CEBPE, oba dobronamjerna obilježja za neutrofilnu diferencijaciju AML staničnih linija (slike 3a-d, ploče gornjeg reda). Zanimljivo je da je propadanje WIPI-2 također rezultiralo poremećenom diferencijacijom neutrofila (slike 3a-d, ploče drugog reda). Ovi rezultati pokazuju da diferencijacija neutrofila ovisi o WIPI funkciji.

Image

Pojačana neutrofilna diferencijacija u NB4 WIPI-1, WIPI-2, PI3KC3, ali ne i u BECN1 knockdown ćelijama. ( a ) SHC002, shWIPI-1, shWIPI-2, shPI3KC3 i shBECN1 koje eksprimiraju NB4 stanice su diferencirane 4 dana, a učinkovitost pri padu mjerena je qPCR. ( b ) Neutrofilna diferencijacija procijenjena je mjerenjem površinske ekspresije CD11b pomoću FACS analize, prikazan je reprezentativni histogram CD11b. ( c ) Prikazani su dijagrami srednjeg intenziteta fluorescencije triju nezavisnih pokusa. ( d ) CEBPE mRNA ekspresija je mjerena qPCR-om u SHC002, shWIPI-1, shWIPI-2, shPI3KC3 i shBECN1 koji eksprimiraju NB4 stanice nakon 1 µM ATRA tretmana nakon 4 dana. ( e ) NBT ispitivanje provedeno je na dan 4 u SHC, shWIPI-1, shWIPI-2, shPI3KC3 i shBECN1 NB4 APL stanice i NBT-pozitivne stanice kvantificirano je iz dva neovisna eksperimenta obavljena u duplikatu. ( f ) Relativno obilje transkripta za WIPI-1 i WIPI-2 izračunato je kako je opisano u. 12 MWU, * P <0, 05. ** P <0, 01, *** P <0, 001. MWU, Mann-Whitney U- test

Slika pune veličine

Da bismo se dalje pozabavili pokretanjem autofagije ovisne o PI3P tijekom diferencijacije APL-a, istraživali smo da li lentivirusno isporučena šRNA ciljanja PI3KC3 ili njegova regulatorna podjedinica Beclin 1 (BECN1) interferira s ATRA-induciranom diferencijacijom neutrofila. Srušavanje PI3KC3 rezultiralo je drastično oslabljenom diferencijacijom neutrofila (slike 3a-d, ploče trećeg reda). Prema tome, inhibiranje proizvodnje PI3P korištenjem malog spoja PI3K inhibitora LY294002 koji inhibira stvaranje WIPI-1 puncta, 13 također je smanjilo obilje CD11b, označavajući diferencijaciju NB4 (dopunska slika 2). Međutim, inhibiranje Beclin 1 nije utjecalo na ATRA-induciranu diferencijaciju neutrofila kao što su slične razine CD11b i CEBPE u kontrolnoj skupini NB4 i Beclin-1-downdown stanice (Slike 3a-d, ploče četvrtog reda). To ukazuje da je funkcija PIP-a ovisna o PI3P kod autofagije potrebna za neutrofilnu diferencijaciju stanica NB4, ali da regulatorna podjedinica kompleksa PI3KC3 Beclin 1 možda neće biti uključena u proizvodnju PI3P u ovoj vrsti ćelije.

Ono što je također važno, također smo testirali da li je padom WIPI-1, WIPI-2, PI3KC3 ili Beclin 1 utjecala neutrofilna funkcija pomoću nitroblue tetrazolija (NBT) koji mjeri proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (slika 3e). Sedamdeset i dva posto kontrolnih stanica transducirano s ne-ciljanim shRNA-ima reduciralo je bezbojni NBT u unutarćelijske tamne naslage nakon 96 h ATRA tretmana (slika 3e). Samo 39% WIPI-1 i 50% WIPI-2 APL padajućih stanica obojilo je NBT pozitivno (Slika 3e, kvantifikacija desno). Slično tome, obustavljanje PI3KC3 oslabljene funkcije neutrofila, dok inhibiranje Beclin 1 nije utjecalo na smanjenje NBT-a nakon diferencijacije neutrofila (Slika 3e). Ovaj rezultat nadalje naglašava da WIPI-1, WIPI-2 i PI3KC3, ali ne i Beclin 1, sudjeluju u ATRA-induciranoj diferencijaciji neutrofila i funkciji stanica mijeloidne leukemije.

Nadalje, izravna usporedba relativnih razina WIPI-1 i WIPI-2 otkrila je da se WIPI-2 (90–99%) izražava više u nediferenciranom i diferenciranom NB4 APL ćeliju nego WIPI-1 (1–10%), što sugerira uloga WIPI-1 koja ograničava brzinu tijekom ATRA-inducirane neutrofilne diferencijacije stanica NB4 (Slika 3f).

Da bismo kontrolirali da li su Beclin-1-knockdown stanice autofagično kompetentne, izmjerili smo stvaranje LC3 puncta i nakon kratkotrajnog gladovanja i ATRA tretmana. 22, 23 Kao što se očekivalo, pad Beclin 1 inhibirao je autofagiju uzrokovanu gladi (dopunska slika 3a, crne trake); međutim, srušavanje Beclin-a 1 nije utjecalo na autofagiju izazvanu ATRA-om (dopunska slika 3a, bijele trake). Nadalje, koristili smo biokemijsku standardnu ​​metodu za određivanje prometa dugovječnih proteina autofagijom i izmjerili proteolizu radioaktivno obilježenih proteina u Beclin-1-knockdown stanicama. 23 Proteoliza u Beclin-1 razbojnim stanicama u bazalnim uvjetima nije značajno smanjena nakon tretmana bafilomicinom A1, dok su uzorci tretirani ATRA-om pokazali značajno smanjenu proteolizu nakon kombiniranog liječenja bafilomicinom A1, što sugerira da bazalna, ali ne ATRA-inducirana autofagija zahtijeva Beclin 1. U skladu s uloga Beclin 1 u autofagiji izazvanoj gladovanjem, Beclin 1-knockdown stanice nisu pokazale pojačanu proteolizu tijekom gladovanja u usporedbi s kontrolnim stanicama (dopunska slika 3b), podržavajući funkciju Beclin 1 u kanoničkoj autofagiji pronađenoj tijekom gladovanja ili tijekom bazalnih stanja, ali a ne tijekom ATRA liječenja. Treba napomenuti da su zabilježeni neovisni ulozi Beclin 1 u autofagičnu sekvestraciju. 5

Autophagija ovisna o WIPI-1- i WIPI-2 tijekom neutrofilne diferencijacije

Zatim smo pitali može li se uključivanje proteina efektora PI3P WIPI-1 i WIPI-2 u diferencijaciji neutrofila, barem dijelom, pripisati njihovoj ulozi u autofagiji. Da bismo riješili ovo pitanje, analizirali smo autofagični tok u NB4 WIPI-1 i WIPI-2 knockdown stanicama LC3-II Western blottingom u prisutnosti ili odsutnosti lizosomalnog inhibitora bafilomicin A1. Pronašli smo značajno smanjene količine endogenog, lipidiranog proteina LC3-II nakon 4 dana ATRA tretmana u kombinaciji s liječenjem bafilomicinom A1, što ukazuje na smanjenu razinu autophagike u tim porušenim stanicama u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 4a). Nadalje, izrazili smo EGFP-Cherry-tagovani LC3 u NB4 WIPI-1 kao i WIPI-2 knockdown stanice. Intracelularna lokalizacija EGFP-Cherry-LC3 vizualizira autofagosomske membrane nakon LC3 lipidiranja. 24 Općenito, i nakon indukcije autofagije (npr. Gladovanja) i inhibicije (npr. Bafilomicin A1) primjećuje se porast LC3 punkta. Korištenjem EGFP-Cherry-LC3, međutim, može se razlikovati indukcija i inhibicija autofagije. Kako je signal EGFP osjetljiviji na kisela i / ili proteolitička stanja lizosomalnog lumena u usporedbi s Cherry signalom, porast crvene LC3 puncta (EGFP - / Cherry + ) po stanici reflektira aktivni autofagični tok i smanjenje kolokalizacije EGFP + / Cherry + signali (žuta puncta) odražavaju inhibiciju autofagije. Korištenjem kontrolnih shRNA, otkrili smo nakupljanje EGFP - / Cherry + LC3 puncta (crveno) na dan 4. ATRA tretmana u usporedbi s netretiranim stanicama što ukazuje na povećani autophagični tok. Nakupljeno je žuto LC3 puncta nakon što je blokirala autofagosomsku degradaciju (bafilomicin A1, Baf A1) tijekom ATRA tretmana (slika 4b). Suprotno tome, kada je ili WIPI-1 ili WIPI-2 srušen lentivirusnim šRNA ciljanjem, akumulacija EGFP - / Cherry + LC3 (crvena) punkta nakon ATRA tretmana je atenuirana, kao i EGFP + / Cherry + (žuta) Formiranje LC3 punkta nakon ATRA i bafilomicin A1 liječenjem (Slika 4b). Pored toga, promet dugovječnih proteina je mjeren u WIPI-1 i WIPI-2 stanicama. Otkrili smo da je proteoliza dugotrajnih proteina sa 14 C obilježena nakon 4 dana ATRA tretmana u kontrolnim stanicama NB4 SHC002. U NB4 WIPI-1 i WIPI-2 ćelijama za obustavu, međutim, ovo povećanje značajno je poništeno (slika 4c i dodatna slika 4a). Nadalje, inhibiranje WIPI-1 regulatora PU.1 uzvodno rezultiralo je i znatnom smanjenjem dugotrajne razgradnje proteina (Slika 4d i dopunska slika 4b). Kako obaranje PU.1 smanjuje ATRA-posredovanu diferencijaciju, koristili smo ATRA-rezistentne stanice NB4-R2 da provjerimo je li smanjena autofagija viđena u PU.1-srušenim stanicama uglavnom zbog oslabljenog potencijala diferencijacije u tim stanicama. Autophagični tok određen bakterijom proteina LC3-II u prisutnosti lizosomskog inhibitora bafilomicin A1 inhibiran je u stanicama NB4-R2 rezistentnih na ATRA (dopunska slika 4c). Ovi podaci jasno pokazuju da je indukcija autofagičnog fluksa povezana s diferencijacijom neutrofila APL stanica.

Image

Pojačana diferencijacija WLP stanica WIPI-1 i WIPI-2 dijelom je dijelom uslijed oslabljene autofagije. ( a ) Autofagični tok je izmjeren u SHC002 i shWIPI-1 ili shWIPI-2 koji eksprimiraju NB4 stanice nakon 1 μM ATRA tretmana 4. dana u prisutnosti ili odsutnosti bafilomicina A1 mjerenjem endogenih razina proteina LC3-II na zapadnom blotu i četiri neovisno izvedeni eksperimenti kvantificirani su. GAPDH korišten je kao kontrola opterećenja. ( b ) Stabilne EGFP-Cherry-LC3 koje eksprimiraju NB4 stanice su transducirane ili sa SHC002, shWIPI-1 ili shWIPI-2, a stanice su tretirane s 1 μM ATRA 4 dana. Bafilomicin A1 dodan je nakon 3 dana. Prikazane su reprezentativne slike EGFP-Cherry-LC3 puncta iz tri neovisno izvedena pokusa. ( c ) Brzina razgradnje dugovječnih proteina izmjerena je u kontrolnim i ATRA-tretiranim SHC002 kontrolnim stanicama ili WIPI-1, WIPI-2, oborenim stanicama, u prisutnosti ili odsutnosti lizosomalnog inhibitora bafilomicina A1. 21 Brzina razgradnje za dugovječne proteine ​​izračunata je kao postotak radioaktivnosti u TCA topljivoj frakciji u odnosu na ukupnu radioaktivnost u netopljivim frakcijama. Nadalje, vrijednosti su oduzete od odgovarajućeg uzorka tretiranog bafilomicinom A1. ( d ) Dugotrajna razgradnja proteina u NB4 SHC002 kontrolnim stanicama i PU.1 porušnim stanicama. Analiza kao u c . MWU, * P <0, 05. ** P <0, 01. MWU, Mann-Whitney U- test

Slika pune veličine

Kako bismo dodatno odredili razine autofagike tijekom ATRA-inducirane diferencijacije u Beclin-1-knockdown stanicama, perfominirali smo dugovječnu degradaciju proteina i tandem EGFP-Cherry-LC3 u danima 4. obustave na dan 4. Inhibicija Beclin 1 nije se značajno smanjila proteoliza proteina dugog vijeka i nikakve razlike za stvaranje punkta EGFP-Cherry-LC3 opažene su u padu Beclin 1 u usporedbi s kontrolnim stanicama nakon 4 dana ATRA tretmana (dopunska slika 4d i e). S druge strane, stanice za obustavu NB4 PI3KC3 pokazale su jasan trend ( P = 0, 07) prema smanjenju autfagijskog toka tijekom diferencijacije APL-a u usporedbi s kontrolnim stanicama (dopunska slika 4e). Da bismo isključili da povećana stanična smrt uzrokuje razlike u testovima fluksa, izveli smo bojenje na Annexin V i propidium jodid (PI). Uočili smo slične povećane razine smrtnosti stanica u Beclin 1, WIPI-1 i PI3KC3 padu u usporedbi s kontrolnim stanicama (dopunska slika 4f). Prema tome, isključujemo da su razlike u staničnoj smrti među različitim stanicama obrušavanja autofagije odgovorne za različiti autofagični tok nakon ATRA tretmana u Beclinu 1 u odnosu na ostale stanice obrušavanja.

Ukratko, blokiranje WIPI-1 ili WIPI-2 i PI3KC3, ali ne i Beclin 1, značajno djelomično smanjuje ATRA-induciranu diferencijaciju neutrofila, barem uslijed oslabljene autofagije.

Rasprava

Deregulacija ekspresije WIPI kod ljudi do sada je opisana samo u različitim čvrste vrste raka, uključujući rak bubrega, gušterače, kože, maternice i jajnika. 11 Sada AML dodajemo na popis karcinoma s izrazito niskim WIPI izrazom. Otkrili smo da se WIPI-1, ali ne i WIPI-2, s izuzetkom APL-a, značajno oslabio u bolesnika s AML-om u usporedbi sa zrelim zdravim neutrofilima. Stoga bi smanjena razina WIPI-1 mogla pridonijeti nezrelom mijeloidnom fenotipu eksplozije AML. Podržavajući ovo promatranje, razine WIPI-1, ali ne i WIPI-2, značajno su regulirane tijekom neutrofilne diferencijacije APL stanica. Međutim, inhibicija WIPI-1 i WIPI-2 značajno su oslabila diferencijaciju neutrofila. To se može objasniti mnogo većom relativnom razinom WIPI-2 u usporedbi s WIPI-1 u NB4 APL ćelijama koje su već dovoljne da omoguće diferencijaciju. Visoka ekspresija WIPI-2 u ovim stanicama može ukazivati ​​na dodatne funkcije WIPI-2 također u nediferencirajućim uvjetima. 12 Nadalje, naši rezultati pokazuju da WIPI-1 i WIPI-2 funkcionalno nisu suvišni tijekom ATRA-inducirane granulocitne diferencijacije, podržavajući tako početno opažanje da svi članovi obitelji WIPI djeluju kao efektori PI3P, ali imaju različite uloge u autofagiji i raku. 11, 25

Analiza transkripcijske regulacije gena ATG još je uvijek u povojima. Nekoliko studija izvijestilo je da p53 obitelj tumorskih supresira ili E2F transkripcijski faktori reguliraju ekspresiju nekoliko ATG gena. 26, 27 Nedavno je GATA-1 identificiran kao prvi hematopoetski transkripcijski faktor koji regulira LC3 / ATG8 obitelj autofagičnih gena koji posreduju mitohondrijski klirens tijekom eritropoeze. 28 Ovdje smo identificirali WIPI-1 kao novu metu PU.1, bitnog transkripcijskog faktora za diferencijaciju neutrofila koji je funkcionalno oslabljen u AML. Daljnja potpora reguliranju transkripcije WIPI-1, posredovana PU.1, Wang i sur. 29 opisano vezivanje PU.1 na mjesto 20 kb uzvodno od transkripcije WIPI-1 tijekom globalnog istraživanja mjesta vezanja PU.1 u U937 AML stanicama. Kako je GATA-1, funkcionalni PU.1 agonist tijekom diferencijacije eritroida, u interakciji s PU.1, vjerojatno će GATA-1 i PU.1 surađivati ​​u kontroli ekspresije gena ATG u stanicama hemtatopoetskih stanica. 30, 31

Kao podaci iz Trocoli i sur. 19 sugeriraju Beclin-ov mehanizam autofagije neovisan tijekom ATRA-inducirane granulocitne diferencijacije, pitali smo da li autofagija potrebna za ATRA-inducirano razlikovanje granulocita ovisi o kanoničkoj PI3P generaciji kao i njihovim PI3P efektorskim proteinima. Pokazali smo da PI3P efektni proteini (WIPI) doprinose ATRA-induciranoj granulocitnoj diferencijaciji. Osim toga, pokazali smo da inhibicija WIPI-1 i WIPI-2 smanjuje protok autofagije tijekom diferencijacije neutrofila izazvanog ATRA-om, što sugerira da ovi proteini podržavaju diferencijaciju neutrofila, barem dijelom, aktiviranjem autofagije. Štoviše, WIPI-1 puncta se povećava nakon ATRA primjene što ukazuje na to da se WIPI-1 veže na autofagosomske membrane, kako je opisano za kanoničku autofagiju 11, 32, a ne samo da povećava lipidizaciju LC3 kao što je opisano za nekanoničnu autofogiju posredovanu resveratrolom. 13 Nadalje, ranije smo pokazali da autofagija povezana s diferencijacijom ovisi o stvaranju punkta ATG5 21, a sada smo pokazali da WIPI-1 / WIPI-2 funkcionira uzvodno od osi ATG5-LC3 kako su opisali drugi. 13, 33 Ako WIPI-2 djeluje uzvodno od WIPI-1 ili obrnuto kako je opisano, 12 još se raspravlja i treba ga bolje istražiti u autofagiji izazvanoj gladovanjem. Zaključno smo identificirali PI3P efektorske proteine, WIPI-1 i WIPI-2 kao pozitivne regulatore diferencijacije neutrofila u APL stanicama.

Kanoničnu autofagiju uglavnom karakterizira stvaranje Beclin 1 / PI3KC3 kompleksa i zahtijeva stvaranje fosfatidolinozitol 3-fosfata (PI3P) signalnog lipida 34 (pregledano u Burman i dr. 35 ). Jasno pokazujemo da neutrofilna diferencijacija APL stanica ovisi o PI3P koristeći farmakološku (LY294002) i genetsku inhibiciju PI3KC3. Obje metode inhibicije PI3P rezultirale su istim fenotipom u pogledu diferencijacije i autofagije, što je u skladu s prethodnim objavljenim podacima. 36 Nadalje se temelji na našoj hipotezi da je PI3P, koji uglavnom, ali ne isključivo, potječe od klase III PI3 kinaza, 37 ključan za diferenciranje neutrofila izazvanih ATRA-om na način ovisan o autofagiji.

Beclin 1, iako enzimski inertan, podržava autofagični proces reguliranjem generacije PI3KC3 ovisne o PI3KC3. 34 Zanimljivo je da Beclin 1 nije oslabio neutrofilnu diferencijaciju niti autfagijski tok za kratkotrajno liječenje kako je procijenjeno mjerenjem endogene LC3 puncta. Na temelju naših dodatnih podataka o padu PI3KC3, WIPI-1 i WIPI-2 koji pokazuju oslabljenu neutrofilnu diferencijaciju zbog atenuirane autofagije, primamljivo je nagađati da započinjanje granulocitične diferencijacije APL-stanica uzrokovano ATRA-om slijedi ne-kanonski, Beclin 1-neovisan, autofagijski put. Uz to, zabilježeno je da ATRA u kombinaciji s everolimusom može poboljšati zaustavljanje i diferencijaciju stanica u stanicama NB4 i HL60, što dodatno ilustrira da autofagija doprinosi diferenciranosti uzrokovanoj ATRA-om. 38

Ukratko, naši podaci jasno podržavaju važnu ulogu autofagije u diferencijaciji APL-a, koja ovisi o osi PI3P-WIPI-1/2-LC3. Konačno, novootkriveni PI3P-WIPI-1/2-LC3 put koji djeluje na neutrofilnoj diferencijaciji APL stanica trebalo bi uzeti u obzir prilikom dizajniranja terapijskih strategija koje ciljaju autofagiju u liječenju raka.

Materijal i metode

Primarni uzorci bolesnika

Skupina od 98 uzoraka bolesnika s AML upisana je na HOVON / SAKK (nizozemsko-belgijsku hematologiju-onkologiju / švicarsku skupinu za skupinu kliničkih istraživanja karcinoma) protokola -04, -04A, -29 i -42. 39, 40, 41, 42, 43 Svi pacijenti dali su pismeni informirani pristanak u skladu s Helsinškom deklaracijom. Pri dijagnosticiranju su uzeti uzorci koštane srži ili koštani uzorci periferne krvi. Blasti i mononuklearne stanice pročišćene su centrifugiranjem Ficoll-Hypaque (Nygaard, Oslo, Norveška) i krio konzervirane. Uzorci AML sadržavali su 80–100% eksplozivnih stanica nakon odmrzavanja, bez obzira na broj eksplozije prilikom dijagnoze. Mutacijske analize i klasifikacije provedene su kako je prethodno opisano. 44 Molimo pogledajte Dodatnu tablicu 1 za karakteristike pacijenta.

Stanične linije i uvjeti kulture

Ljudske stanice akutne promeelocitne leukemije (APL) NB4 i njegov subklon 45 rezistentnih na ATRA NB4-R2 ljubazno su osigurali BETorbett. Stanične stanice uzgajane su u mediju RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Buchs, Švicarska) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma, 50 U / ml penicilina i 50 μg / ml streptomicina u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO 2 na 37 ° C, Diferenciranje NB4 stanica je inducirano s 1 µM ATRA tijekom 4 do 6 dana. Uspješna diferencijacija neutrofila procijenjena je FACS analizom CD11b proteina ili kvantitativnom RT-PCR (qPCR) za ekspresiju mRNA CEBPE. Funkcionalna diferencijacija testirana je testom redukcije NBT-a 46, izveden kako slijedi: stanice su isprane PBS-om i tretirane s NBT / PMA 20 min na 37 ° C, 5% CO2. Nakon inkubacije, stanice su prenesene citospinom na staklene slojeve presvučene staklenkama i suprotstavljene Safraninu O. Broj stanica pozitivnih na NBT. Najmanje 200 stanica dobiveno je za svako određivanje iz dva neovisna pokusa obavljena u duplikatu. Podaci su izraženi kao postotak NBT-pozitivnog broja stanica u odnosu na broj održivih stanica. Stanična smrt u SHC002 ili shWIPI-1, shPI3KC3 i shBECN1 transfektiranim stanicama nakon ATRA tretmana određena je primjenom bojenja i protočne citometrije bojenjem AnnexinV / PI. Izolacija primarnih neutrofila izvedena je pomoću polimorfprepa (AXIS-SHIELD, Axon Lab, Baden, Švicarska). Stanice su pažljivo slojene preko Polymorphprep i centrifugirane su 40 minuta pri 400 g na sobnoj temperaturi. Primarni neutrofili su sakupljeni i RNA je izolirana kako je opisano u nastavku.

TaqMan niz niske gustoće i qRT-PCR u stvarnom vremenu (qPCR)

Ekstrakcija RNA, RT-PCR, mjerenja nizova gustoće kao i analiza podataka provedeni su kako je opisano. 47 Analiza ekspresije gena za WIPI-1, WIPI-2, PI3KC3, BECN1 i CEBPE korištena u 96-jažnom formatu na sustavu za prepoznavanje redoslijeda ABI 7500 bili su Hs00215872_m1, Hs00255379_m1, Hs00176908_m1, Hs00186800ms, Hs00186838_m1, Hs65186838_m1, Hs00186838_s1, Švicarska). HMBS prajmer i sonde su prethodno opisani. 48

Autofagijski testovi

ATRA-inducirana autofagija blokirana je korištenjem bafilomicina A1 (BML-CM110, Enzo Life Sciences, Lausen, Švicarska) 100 nM ili 200 nM. Upotrijebljen je LY294002 (L9908, Sigma-Aldrich) u koncentraciji od 10 µM. U analizi je inducirano gladovanje (EBSS, Sigma-Aldrich (E2888) 5 sati prije analize. Ispitivanje razgradnje proteina izvedeno je kao što slijedi. Stanice su tretirane sa ili bez ATRA-e i bafilomicinom A1 4 dana. Nakon 2 dana liječenja ATRA dodano je 0, 3 μCi14 C-valin (L- (U-14-C) valin, kod CFB.75, Amersham) po ml / jažici. Dodavanje bafilomicina A1 izvršeno je 24 sata prije analize. Na dan 4, ispitivanje je provedeno kao što je opisano u 49. Kratkotrajna ispitivanja izvedena su kako slijedi: stanice se inkubiraju 2 dana s 0, 3 µCi14C -valinom po ml / jažici. 2. dana, ispitivanje je provedeno kao što je opisano u. 49

Western blotting

Cjelokupni ekstrakti stanica pripravljeni su korištenjem RIPA ili alternativno u puferu za lizu koji sadrži aminokapronsku kiselinu, 50 mM Bis-Tris, 0, 5 mM EDTA, 1% Triton-X100, nadopunjeno koktelom inhibitora proteinaze (kompletan, Roche Diagnostics, Rotkreuz, Švicarska). Osamdeset do 120 μg ukupnog proteina razdvojeno je na 12% SDS-poliakrilamidnom gelu i preneseno na membranu. Klice su inkubirane s primarnim antitijelom u TBS 0, 05% Tween-20/3% BSA preko noći na 4 ° C, isprane i inkubirane 1 sat na sekundarnoj antitijelu povezanog s mišem ili protiv zeca na sobnoj temperaturi zaštićenoj od svjetlosti. Primarna protutijela koja su korištena su anti-LC3B (NB600-1384; Novus Biologicals (LuBioScience), Luzern, Švicarska), anti-WIPI-1 antiserum 11 i anti-GAPDH (MAB374; Millipore, Zug, Švicarska). Sekundarna protutijela bila su koza (poliklonski) anti-mišji IgG (H + L), konjugirani s infracrvenom 680LT, (LICOR) (1: 10 000) i kozji (poliklonski) konjugirani infracrveni RedDye 800CW (H +) L) (LI-COR). Podaci su analizirani pomoću LI-COR Odyssey infracrvenog imagera (Odyssey, Bad Homburg, Njemačka).

Analiza prekrivanja fosfolipida i proteina

Aminokapronska kiselina, 50 mM Bis-Tris, 0, 5 mM EDTA, 1% Triton-X 100 sa dodatkom koktela inhibitora proteinaze (kompletan, Roche Diagnostics) sa dodatkom TBS + 0, 5% Tween u 3% BSA korišteni su za prekrivanje membrana imobiliziranog fosfolipidom membrane (Echelon Biosciences Inc., Salt Lake City, UT, SAD; P-6001). Otkrivanje vezanog proteina WIPI-1 pomoću anti-WIPI-1 antiseruma provedeno je kao što je gore opisano.

ChIP test

Test imunoprecipitacije kromatina (ChIP) izveden je kao što je opisano. 40 Genomskih regija koja sadrže pretpostavljena mjesta vezanja PU.1 amplificirana je PCR-om pomoću sljedećih primera: mjesto A; naprijed 5 '-TGGTTGGGTGCCATGAATGACCA-3' i natrag 5 '-TGCACAGGGCATTCACAGGGG-3', mjesto B; naprijed 5 '-AGCAACCCAATGGGCTTCCCCT-3' i natrag 5 '-GGAAGGGGGGAGGGGCAGGGA-3', mjesto C; naprijed 5 '-ACTGGACAGCAATGCCTGAAAACA-3' i natrag 5 '-TGGCCAGGGTTTCCAAACAAAA-3', mjesto D; naprijed 5 '-GCTGCGGATCGGATAGGTCTTGT-3' i natrag 5 '-TGACGGAGCTGGAAGGTGGGG-3'. Pored toga, nepovezani niz u gAPDH genu korišten je kao negativna kontrola. 50

Stvaranje stabilnih staničnih stanica i EGFP-Cherry-LC3 ekspresijskih stanica

pLKO.1 lentivirusni vektori koji izražavaju male (sh) RNA koje ciljaju WIPI-1, WIPI-2, PI3KC3 i BECN1 ili neciljanu šRNA kontrolu (SHCOO2) kupljeni su od Sigma-Aldrich. Lentivirusni vektor koji eksprimira EGFP-Cherry-LC3 pružio je dr. MS Soengas. Proizvodnja leća i transdukcija stanica NB4 obavljene su kako je opisano. 51 EGFP-Cherry-LC3 NB4 stanice sa WIPI-1, WIPI-2 i BECN1 padom generirane su serijskom transdukcijom s oba lentivirusna vektora opisana gore. Transducirane stanične populacije odabrane su tijekom 4 dana koristeći 1, 5 μg / ml puromicina. qPCR je proveden za procjenu učinkovitosti obustave u knockdown ćelijama NB4 WIPI-1, WIPI-2 i BECN1, dok je zapadno blotiranje korišteno za demonstraciju inhibicije beclin 1. Da bi se generirale PU.1-inducibilne stanice, pCl10A1 retrovirusni ambalažni plazmid i pBabe-PUER-puro (ljubazno osigurao dr. H Yoshida) kofeficirani su u stanice 293T. Medij stanične kulture uklonjen je nakon 1 dana i stanice se inkubiraju 2 min s PBS / 15% glicerolom. PBS / 15% glicerola zamijenjen je svježim medijem. Virusni supernatanti su sakupljeni 48 sati kasnije. NB4 stanice transducirane su tijekom 24 sata u prisutnosti 8 μg / ml polibrena. Transducirane populacije stanica NB4 odabrane su s 1, 5 µg / ml puromicina tijekom 4 dana.

Fluorescentna mikroskopija

EGFP-Cherry-LC3 eksprimirajuće NB4 stanice su fiksirane s 2% paraformaldehida ispranim PBS-om (0, 5% glicina). Nakon toga, stanice su stavljene na pokrovno staklo prekriveno poli-L-lizinom i montirane u Fluorescentno ugradnju medija (S3032; DAKO, Baar, Švicarska). Slike su snimljene na konfokalnom mikroskopu pri povećanju × 60 za punkta test i na fluorescentnom mikroskopu za NBT test.

Imunofluorescentna mikroskopija

Stanice su fiksirane s 2% paraformaldehida ispranim PBS-om (0, 5% glicina). Nakon toga, stanice su stavljene na pokrovno staklo prekriveno poli-L-lizinom, permeabilizirano tritonom. Alternativno, stanice su fiksirane ledenim hladnim metanolom 4 minute nakon citospuna, a zatim isprane PBS-om (0, 5% glicina). Inkubacija anti-WIPI-1 i anti-LC3B antitijela 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega slijedi tri koraka pranja s PBS-T. Stanice se inkubiraju s drugim antitijelom (111-096-045, Jackson Immuno Research, Suffolk, Velika Britanija) 1 sat na sobnoj temperaturi. Prije ugradnje u fluorescentno sredstvo za ugradnju (S3032; DAKO) stanice su isprane tri puta s PBS-T. Slike su snimljene na konfokalnom mikroskopu pri povećanju × 60.

Statistička analiza

Neparametrični Mann-Whitney U- testovi primijenjeni su za usporedbu razlike između dvije skupine pomoću programa GraphPad Prism 4 (Graph Pad Software, San Diego, CA, SAD). P- vrijednosti <0, 05 smatrale su se statistički značajnim.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

AML

akutna mijeloidna leukemija

APL

akutna promielocitna leukemija

ATRA

all- trans retinoična kiselina

PI3P

fosfatidilinozitol 3-fosfat

WIPI

WD-ponavlja protein koji djeluje u interakciji s fosfoinozidima

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)